atomo ene 12

 

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no registro issn 00000349 sapere aude año 1 número 11 enero 2012 sapere aude saatomo produccion de biosurfactantes por bacterias fijadoras de nitrogeno crecidas en hidrocarburos del petroleo sandoval gonzález valeria claudia castañeda lópez1 graciano calva calva2 josefina pérez vargas1 1tecnológico de estudios superiores de ecatepec av tecnológico s/n col valle de anáhuac ecatepec de morelos estado de méxico cp 55210 2biotecnología cinvestav av ipn 2508 san pero zacatenco méxico d f fax 50613313 universidad tecnológica de tecámac km 37,5 carretera federal méxico-pachuca sierra hermosa tecámac edo de méx valeria730308@hotmail.com55 593-88-400 bonita_eri79@yahoo.com.mx israel_rodriguez_m@yahoo.com.mx corresponding author mabelqz@yahoo.com.mx palabras clave biosurfactante bacteria jadora de nitrógeno hidrocarburos tensión super cial remoción de hidrocarburos introducciÓn la contaminación ambiental producida por hidrocarburos es uno de los principales problemas con los que se enfrenta la zona sur de méxico la posibilidad de utilizar microorganismos para la recuperación de los sitios está limitada por la concentración del hidrocarburo y la biodisponibilidad del mismo entre otros factores una tecnología prometedora es la utilización de agentes tensoactivos que permitan aumentar la biodisponibililidad del hidrocarburo estos son utilizados en la explotación de pozos de petróleo manipulación y transporte de combustibles para la emulsi cación del crudo en biorremediación en la industria médico­farmaceútica de perfumería y cosméticos de materiales de construcción y otras los biotensoactivos son compuestos producidos durante el crecimiento de diversos géneros microbianos sobre sustratos de diferente naturaleza produce una gran variedad de estructuras que dependen del microorganismo y las condiciones de fermentación para su producción 1 sapere aude los surfactantes son moléculas an páticas o an fílicas que contienen en su estructura una parte hidrofílica y otra hidrofóbica formando interfases aceite/agua o aire/agua lo que depende de su concentración micelar crítica cmc de nida por la solubilidad del surfactante en una fase acuosa y utilizado para medir la e ciencia del surfactante 2 3 esta característica permite que los surfactantes modi quen la tensión super cial e interfacial favoreciendo la formación de emulsiones y la capacidad de detergencia espumante y dispersante lo que hace que los procesos químicos sean más versátiles 2 los biosurfactantes presentan varias ventajas sobre los surfactantes químicos como baja toxicidad alta biodegradabilidad alto poder espumante alta selectividad y actividad especí ca a extremas temperaturas ph y salinidad 3 los surfactantes sintetizados químicamente son clasi cados de acuerdo a la naturaleza de su grupo polar mientras los biosurfactantes son caracterizados principalmente por su composición química y su origen microbiano en general sus estructuras incluyen la parte hidrofílica que frecuentemente consiste de aminoácidos o péptidos aniones o cationes mono di o polisacáridos y la parte hidrofóbica que atomosa 05 registro de derechos de autor 04-2011-101713375500-203

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sapere aude año 1 número 11 enero 2012 no registro issn 00000349 sapere aude saatomo consiste de ácidos grasos saturados e insaturados de acuerdo a lo anterior las clases generales de biosurfactantes incluyen glicolípidos lipopéptidos y lipoproteínas fosfolípidos y ácidos grasos surfactantes poliméricos y partículas de surfactantes 3 la biorremediación puede ser una alternativa conveniente y a costo efectivo si se utiliza la micro ora autóctona eventualmente aclimatada a los contaminantes para la remediación del sitio los consorcios microbianos juegan un papel importante en la biodegradación y eventual remoción de hidrocarburos y otros contaminantes el uso de consorcios especializados ofrece varias ventajas sobre cultivos puros principalmente por el sinergismo entre microorganismos autóctonos del sitio contaminado lo que hace más efectiva la remoción de contaminantes y sustratos complejos sin embargo por la misma razón el papel de las cepas o grupos microbianos individuales no pueden ser evaluados fácilmente en estudios recientes se ha reportado que bacterias jadoras de nitrógeno atmosférico de vida libre bfna son las bacterias más abundantes en los sitios contaminados con queroseno cuando fueron tratados con plantas para la recuperación por torremediación en un intento por entender este papel y para investigar si la relación entre la jación de nitrógeno y la capacidad de remoción de queroseno existe en un estudio previo nuestro grupo aisló un consorcio de bfna de vida libre de sitios contaminados con queroseno y tratados por torremediación 6 7 el consorcio fue capaz de utilizar el queroseno como única fuente de carbono y remover arriba del 75 de la concentración inicial 5000 ppm en ensayos de cultivo sumergido interesantemente se observó que estas bacterias además de jar nitrógeno pueden producir agentes tensoactivos en altas cantidades utilizando hidrocarburos como única fuente de carbono estas bacterias pueden producir el exopolímero en un periodo de 5 días cuando se les crece en queroseno como única fuente de carbono una característica no reportada para este tipo de microorganismos 6 en otros estudios previos 9 se determinó la capacidad de crecimiento de bfna aisladas de sitios contaminados con petróleo crudo en hidrocarburos aromáticos ahora se complementa con el conocimiento de la capacidad de estos cultivos en la producción de biotensoactivos o biosurfactantes para ello se seleccionó el cultivo que produjo el exopolímero con el mayor poder emulsi cante de acuerdo a estos resultados un cultivo color crema cc fue seleccionado para determinar su capacidad emulsi cante cuando se crece en fenantreno así el objetivo de este estudio fue investigar la productividad de esa bacteria para producir compuestos tensoactivos materiales y mÉtodos cultivos de bfna utilizadas en este estudio los microorganismos fueron aislados de suelos de tabasco contaminados por petróleo crudo y se crecieron en el medio de rennie 1987 a 28 oc y 120 rpm por un periodo de 4 días transcurrido este tiempo los cultivos son pasados a medio nuevo de rennie modi cado sustituyendo las fuentes convencionales de carbono por 5 g/l de queroseno e incubados a bajo las mismas condiciones por 4 días para seleccionar aquellos con capacidad de crecer en el hidrocarburo los cultivos aislados muestran colonias con color característico por el cual se les nombró de la siguiente manera cc atomo 06 sapere aude s a registro de derechos de autor 04-2011-101713375500-203

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no registro issn 00000349 sapere aude año 1 número 11 enero 2012 saatomo cultivo crema cb cultivo blanco cs cultivo salmón caf cultivo amarillo fuerte cn cultivo naranja ct cultivo transparente cac cultivo amarillo claro estudios de remoción de hidrocarburos siete cultivos de bfna aislados del suelo rizosférico de plantas crecidas en un sitio contaminado con petróleo fueron crecidos en medio de rennie 8 y de rennie modi cado 6 7 sustituyendo la sacarosa y manitol por queroseno o fenantreno en un concentración de 5 g/l o 1.5 g/l respectivamente los cultivos fueron incubados en una agitadora orbital a 120 rpm 28 oc durante 72 horas al cabo de las cuales se les adicionó el hidrocarburo correspondiente según el experimento los cultivos alimentados se incubaron bajo las mismas condiciones durante 12 días la remoción de hidrocarburos se determinó por extracciones líquido/líquido utilizando diclorometano como fase orgánica de extracción de hidrocarburos remanentes de acuerdo al método de la epa 8015 modi cado de acuerdo a pérez y col 6 7 indice de emulsi cación ie24 la determinación del índice de emulsi cación se realizó de acuerdo a la reportada por cooper y goldenberg 2 con algunas modi caciones el ie24 se determinó para muestras de cultivos completos por triplicado en cada tiempo de la cinética de crecimiento de cada uno de los siete microorganismos aislados se tomaron tres muestras de cultivos completos diariamente por 11 días se centrifugaron para eliminar la biomasa y el medio de cultivo se usó para determinar el ie24 la capacidad emulsi cante se reportó como ie24 tomando el porcentaje de la altura de la columna de emulsi cación con respecto a la altura total del líquido y utilizando como estándar una solución de tween 80 al 1 tensión super cial se determinó con un tensiómetro csc-dunoüy modelo 70535 en 20 ml de muestra colocados en un vaso de precipitado ajustando a cero y sumergiendo posteriormente el anillo en una profundidad de 5 mm y elevando el anillo hasta sacar el aro de la muestra hasta un desprendimiento total de la muestra se toma la lectura obtenida en el vernier que proporciona el resultado en dinas/cm resultados y discusion se aislaron siete cultivos de bacterias jadoras de nitrógeno atmosférico a partir de suelos contaminados con petróleo y provenientes de la zona de tabasco proporcionados por el laboratorio de ingeniería metabólica del departamento de biotecnología del cinvestav los cultivos obtenidos se identi caron por la coloración de sus colonias como cac cultivo amarillo claro caf cultivo amarillo fuerte cn cultivo naranja cs cultivo salmón ct cultivo transparente cb cultivo blanco y cc cultivo crema los siete cultivos tuvieron la capacidad de crecer en queroseno y fenantreno pero sólo cuatro mostraron producción de exopolímeros cuando se crecieron en queroseno como única fuente de carbono lo cual se evaluó mediante su índice de emulsi cación figura 1 el cultivo que presentó mayor índice de emulsi cación fue el color crema por lo cual fue seleccionado para estudiar posteriormente el efecto de la fuente de atomo sapere aude s a 07 registro de derechos de autor 04-2011-101713375500-203

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sapere aude año 1 número 11 enero 2012 no registro issn 00000349 sapere aude saatomo carbono sobre el crecimiento y producción del exopolímero como puede observarse el cultivo color crema cc mostró un alto poder emulsi cante en comparación con los cultivos cb cs y caf que también producen el biosurfactante pero su poder emulsi cante fue menor al encontrado para la cc es importante mencionar que durante la etapa de aclimatación a queroseno los siete cultivos mostraron capacidad de crecer en este hidrocarburo y en fenantreno pero nalmente no todos produjeron exopolímeros resultados que concuerdan con trabajos previos realizados con bfna aisladas de suelos contaminados con queroseno 7 9 debe notarse que la producción del exopolímero evaluada por el índice de emulsi cación llega a un máximo cuando los cultivos han salido de su fase lag y han entrado a la logarítmica de crecimiento figura 2 por ejemplo el cultivo cc produjo el biotensoactivo en un periodo de 4 a 7 días mientras los otros 3 cultivos lo presentan después de 4 o más días esto sugiere que es necesaria la formación del exopolímero para emulsi car la fuente de carbono haciéndola más accesible a las células y así estas puedan iniciar su desarrollo si esto ocurre así entonces el per l de producción de estos compuestos sería parcialmente asociado al crecimiento y sería difícil clasi carlo dentro de los metabolitos secundarios 10 capacidad emulsi cante del cc crecido en fenantreno la cinética de remoción de fenantreno por el cultivo cc mostró que este microorganismo puede remover hasta un 17 de este compuesto figura 2 como puede observarse la utilización del hidrocarburo empezó hasta las 48 horas lo que concuerda con los resultados observados con queroseno figura 1 se puede observar que el aumento en la velocidad de la asimilación de fenantreno coincide con la aparición de la actividad emulsi cante aun cuando no se observa una alta remoción del 100 el cultivo mantiene el compuesto mas disperso en el medio de cultivo una vez que el tensoacivo se ha producido esto refuerza la hipótesis anterior de que la presencia del emulsi cante aumenta la biodisponibilidad del hidrocarburo es decir la fuente de carbono es insoluble en el medio acuoso y a medida que el microorganismo produce el emulsi cante aumenta lo hace más soluble y por tanto más accesible a la acción de la atomo figura 1 fase lag y exponencial para el crecimiento de la cc a e índice de emulsi cación en función del tiempo para cultivos de bfna crecidas en queroseno como única fuente de carbono b cc cultivo crema · cb cultivo blanco × cs cultivo salmón caf cultivo amarillo fuerte cn cultivo naranja ct cultivo transparente · cac cultivo amarillo claro 08 sapere aude s a registro de derechos de autor 04-2011-101713375500-203

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no registro issn 00000349 sapere aude año 1 número 11 enero 2012 saatomo maquinaria bioquímica necesaria para asimilarlo el porque el fenantreno no fue completamente removido aún es incierto y requiere de más estudios no obstante estos resultados demuestran que esta bfna puede mantener su capacidad de crecimiento y producción de biosurfactantes cuando se crece en una fuente de carbono aromática y recalcitrante lo que permitirá estudiar la enzimología involucrada en la degradación de estos compuestos y el uso potencial de estos microorganismos en planes de biorremediación de sitios contaminados con compuestos similares hidrocarburo el cual es prácticamente insoluble en agua quizá el objetivo del microorganismo no está solamente de nido a mantener en solución estratégicamente al hidrocarburo sino al mismo tiempo protegerse de su toxicidad creando una capa del exopolímero en su super cie celular es importante destacar que no se encontraron reportes en la literatura acerca de estudios con cultivos bfna degradadotas de hidrocarburos y enfocados a estudiar su producción de agentes emulsi cantes o tensoactivos otra característica relacionadas a la producción del tensoactivo y evaluada en estos cultivos fue la tensión super cial figura 3 como era de esperarse la tensión super cial aumentó con la producción de emulsi cante y con el consumo de fenantreno durante la fase de adaptación de las células al medio de cultivo sin embargo cuando el índice de emulsi cación y el fenantreno llegan a toma valores en un rango constante la tensión super cial cae hasta tomar valores similares a los tiempos iniciales del cultivo estos resultados al nal del cultivo pueden parecer contradictorios pero pueden deberse a que en la fase de adaptación a una fuente de carbono tan tóxica y recalcitrante provoca que las células produzcan el tensoactivo para protegerse y al mimo tiempo catabolizar el compuesto una vez superada la toxicidad del compuesto que puede ser por ejemplo por atrapamiento e inmovilización en las micelas formadas por el emulsi cante entonces el catabolismo empieza a funcionar eliminando al hidrocarburo del medio y recuperando la tensión super cial original esta hipótesis está bajo estudio atomo figura 2.cinética de remoción de fenantrenoa e índice de emulsi cación b para cultivos de la colonia crema cc crecida en fenantreno como única fuente de carbono sapere aude s a el índice de emulsi cación para el cultivo cc crecido en fenantreno resultó del 30 mientras que la misma bacteria crecida en queroseno el cual contiene más de 200 compuestos produjo un 70 es necesario resaltar que aún cuando el índice de emulsi cación no es muy alto la cantidad producida parece su ciente para que el cultivo mantenga en solución al 09 registro de derechos de autor 04-2011-101713375500-203

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sapere aude año 1 número 11 enero 2012 no registro issn 00000349 sapere aude saatomo referencias 1.almazan v gonzález j.m dieguez f villaverde m.j pérez g joseph n gan r 2000 puri cación e identi cación de la naturaleza química de un tensoactivo producido por pseudomonas aeruginosa cepa ido-330 revista biología 142 172-177 2.cooper g.d and goldenberg g.b 1991 surface active agents from two bacillus species appl environ microbiol 53 2 224-229 3.desai j and banat i 1997 microbial production of surfactants and their commercial potential microbiology and molecular biology reviews 611 47-64 4.koch a.k käppeli o fiechter a reiser j 1981 hydrocarbon assimilation and biosurfactant production in pseudomonas aeruginosa mutants j bacteriol 173 13 4212-4219 5.kosaric n 2001 biosurfactants and their application for soil bioremediation food technol biotech 394 295-304 6.pérez v j esparza g f ferrera-cerrato r poggi v h.m rodríguez v r calva c g and rios l e 2000 nitrogen xing bacteria capable of utilising kerosene hydrocarbons as a sole carbon source water sci technol 42 5,6 407-410 7.pérez vargas jose na tesis de doctorado cinvestav 2002 8.rennie r.j 1987 a single medium for the isolation of acetylene-reducing dinitrogen xing bacteria from soils can j microbiol 27 9.pérez vargas j palma cruz f castañeda lópez c garcía rivero m martinez trujillo a y calva calva g 2006 degradación microbiana de hidrocarburos aromáticos por bacterias jadoras de nitrógeno atmosférico aisladas de suelos contaminados de tabasco environmental biotechnology and bioengineering proceedings from the second international meeting on environmental biotechnology and engineering 2imebe mexico d.f cd 10 vining l.c 1986 secondary metabolism in biotechnology v microbial products ii pape h and h j rehm eds pags 19-38 v c h publishers figura 3 tensión super cial del medio de cultivo del cc crecido en medio de rennie suplementado con 1500 ppm de fenantreno como única fuente de carbono conclusiones y perspectivas se aisló una seria de microorganismos de vida libre jadores de nitrógeno atmosférico las cuales han mostrado la capacidad de producir agentes emulsi cantes cuando se crecen en condiciones de jación de nitrógeno y utilizando hidrocarburos como única fuente de carbono una cepa que forma colonias color crema logró crecer 5000 ppm queroseno y 1500 fenantreno mostrando una remoción del 75 y del 17 respectivamente estos resultados dan la posibilidad de la aplicación de estos microorganismo para la producción de un agente emulsi cante a partir de hidrocarburos y para tecnologías de biorremediación de sitios impactados por derrames de petróleo y otros hidrocarburos atomo 10 sapere aude registro de derechos de autor 04-2011-101713375500-203 s a

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