Dissertação Mirian Bicho

 

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Dissertação Mirian Bicho

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universidade federal do rio grande instituto de ciências biológicas pós-graduação em biologia de ambientes aquáticos continentais a v al i ação d a to xi ci d ad eedeg rad ação d o carb o f u ran opor ci n co es p é ci e s fi to p l an ctô n i cas dulcí co l as s u b tro p i cai s mirian da silva bicho orientador danilo giroldo rio grande 2012 1

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universidade federal do rio grande instituto de ciências biológicas pós-graduação em biologia de ambientes aquáticos continentais a v al i ação d a to xi ci d ad eedeg rad ação d o carb o f u ran opor ci n co es p é ci e s fi to p l an ctô n i cas dulcí co l as s u b tro p i cai s aluno mirian da silva bicho orientador danilo giroldo dissertação apresentada ao programa de pós-graduação em biologia de ambientes aquáticos continentais como requisito parcial para a obtenção do título de mestre em biologia de ambientes aquáticos continentais rio grande 2012 2

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agradecimentos aos meus pais pela vida amor apoio confiança e incentivo durante toda minha vida a minha avó teresa que me acolheu com muito amor e carinho e se fez presente nos bons e maus momentos da minha vida aos meus irmãos que me incentivaram e se fizeram presentes em todos os momentos da minha vida tornando-se parte indispensável no meu dia-a-dia ao meu amor amigo e companheiro valvitez que respeita e apóia dia-a-dia minhas decisões tornando os dias mais fáceis e felizes a toda minha família tios tias primos primas afilhado pelo apoio e amor durante a minha vida em especial a rosangela e angélica que estiveram comigo me apoiando principalmente na minha vida acadêmica aos amigos adquiridos ao longo da vida tati cris e ita pelas horas de felicidade amor e carinho e por terem conseguido fazer parte da família sem que eu ao menos tenha percebido aos amigos da vida acadêmica roberta carol da matta pelas risadas dificuldades vencidas e a carol igansi pela amizade e carinho e dias de estudos e discussões que nos levaram ao mestrado aos amigos do grupo fito lucas pablo daniele tchana layanna e savênia amiga e coautora pelas discussões momentos de descontração companhia e diversão nos congressos ao prof dr danilo giroldo pela orientação incentivo na vida acadêmica por ter servido de exemplo como profissional e principalmente pela oportunidade e confiança que me permitiu executar este trabalho a todo pessoal do laboratório de limnologia pelo espaço auxilio disponibilidade e principalmente aqueles que apareciam na sala de microscopia e me descontraiam durante as intermináveis horas de contagem ao prof dr ednei primel e a mestre sergiane caldas da escola de química e alimentos furg que colaboraram com as determinações do carbofurano ao sesu/mec pela bolsa reuni e pronex cnpq/fapergs pelo auxilio financeiro ao projeto 3

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resumo o desenvolvimento de atividades agrícolas e industriais tem conduzido à contaminação de ambientes aquáticos por compostos químicos raramente ou nunca encontrados na natureza os pesticidas incluindo os inseticidas que são frequentemente usados para reduzir ou eliminar pragas trazem grandes preocupações à população pelo seu uso indiscriminado o carbofurano é um inseticida de amplo espectro utilizado mundialmente cuja toxicidade para o fitoplâncton tem sido pouco estudada bem como o potencial de sua degradação este trabalho visa avaliar a influência do carbofurano no crescimento de cinco espécies fitoplanctônicas dulcícolas subtropicais bem como a degradação deste composto pelas microalgas foram montadas culturas de desmodesmus communis cosmarium depressum var planctonicum pediastrum boryanum spondylosium pygmaeum e xanthidium antilopaeum com adição de seis concentrações de carbofurano 10 100 500 1.000 5.000 e 10.000 g/l um controle com algas e sem carbofurano e outro sem algas e com carbofurano foram preparados para mensurar o crescimento padrão e a degradação não biológica respectivamente as culturas triplicata foram mantidas por aproximadamente 13 dias para análise dos parâmetros de crescimento e toxicológicos além disso foi avaliada a concentração de carbofurano por espectrometria de massa lc-esi-ms/ms no início e no final dos experimentos quatro cepas apresentaram diferenças significativas entre o crescimento observado no controle e as concentrações mais elevadas enquanto pediastrum boryanum não apresentou toxicidade desmodesmus communis e xanthidium antilopaeum apresentaram maior crescimento na nas concentrações intermediárias de carbofurano possivelmente relacionado à metabolização e utilização do composto as análises de carbofurano demonstraram degradação de aproximadamente 100 na presença das cepas enquanto a degradação não biológica foi de no máximo 50 este processo já foi bem estudado em bactérias e fungos enquanto para microalgas apenas a degradação de outros pesticidas havia sido documentada sendo este o primeiro registro de degradação do carbofurano pelo fitoplâncton palavras-chave inseticida microalga cultivo biodegradação inibição 4

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abstract pesticides such as insecticides have risen public concerning on their uncontrolled use carbofuran is a broad spectra worldwide used insecticide whose toxicity for the phytoplankton has been scarcely studied as well as its potential degradation this work aims to evaluate the carbofuran influence on the growth of five subtropical freshwater phytoplanktonic strains as well as the degradation of this pesticide by microalgae experimental cultures of desmodesmus communis cosmarium depressum var planctonicum pediastrum boryanum spondylosium pygmaeum and xanthidium antilopaeum were prepared with six carbofuran concentration 10 100 500 1,000 5,000 and 10,000 mg/l also two controls were prepared to measure the regular growth of each microalgae and the non-biological degradation processes cultures triplicates were maintained for approximately 13 days in order to determine both growth and toxicological parameters besides we evaluated the carbofuran concentration by mass spectrometry lc-esi-ms/ms in the beginning and in the end of the experiment we found significant differences in the growth of high concentration carbofuran exposed cultures for four strains and only p boryanum showed no growth inhibition d communis and x antilopaeum showed growth enhancement in intermediary carbofuran concentrations probably related to the metabolization of this pesticide which has been only reported to bacteria before all strains were able to degrade almost 100 of the added carbofuran while the non-biological degradation was up to 50 carbofuran degradation was only demonstrated before by bacteria and fungi species our data showed for the first time carbofuran degradation by phytoplanktonic strains keywords insecticide microalgae cultivation biodegradation inhibition 5

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sumário agradecimentos resumo abstract 1 introdução 2 objetivo 3 artigo a ser submetido ao periódico jounal of phycology 3.1 introdução 3.2 materiais e métodos 3.2.1 organismos e condições de cultivo 3.2.2 experimentos 3.2.3 amostragem 3.2.4 análises estatísticas 3.3 resultados 3.3.1 crescimento celular 3.3.2 degradação do carbofurano 3.4 discussão 3.5 conclusão 3.6 referência bibliográfica 3 4 5 7 12 13 15 16 16 17 18 19 20 20 35 37 40 41 3.7 anexos 3.7.1 normas do periódico jounal of phycology 3.7.2 figuras estrutura molecular carbofurano e cepas 45 45 54 6

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1 introduÇÃo as algas são organismos morfologicamente muito variados compreendendo desde microalgas unicelulares até macroalgas com dezenas de metros de comprimento apresentam ampla distribuição geográfica ocorrendo em oceanos água doce solos rochas geleiras árvores desertos entre outros graças às suas eficientes adaptações morfo-fisiológicas van den hoek et al 1995 as microalgas adaptadas a viver parcialmente ou continuamente em águas abertas compõem o fitoplâncton um importante compartimento ecológico dos sistemas aquáticos reynolds 2006 a comunidade fitoplanctônica consiste num conjunto diversificado de algas tendo como principais representantes na água doce as algas verdes divisão chlorophyta as cianobactérias divisão cyanobacteria as diatomáceas divisão ochrophyta classe bacillariophyceae as crisofíceas divisão ochrophyta classe chrysophyceae os dinoflagelados divisão dinophyta e as euglenofíceas divisão euglenophyta van den hoek 1995 esteves 1998 reynolds 2006 estes organismos desempenham importantes funções ecológicas tais como a maior parte da produção primária de ambientes pelágicos a produção de oxigênio e de compostos orgânicos extracelulares além de refletir as características do sistema funcionando como eficientes bioindicadores reynolds 2006 o critério fundamental para estimar o estado ecológico das massas de água é a biodiversidade a complexidade da organização estrutural-funcional do ecossistema aquático e o seu grau de estabilidade embora corpos de água que não estejam sujeitos a alterações antrópicas sejam raros a conservação da qualidade da água é necessária para preservar a saúde da população a biodiversidade bem como as potencialidades paisagísticas e de lazer da natureza as comunidades fitoplantônicas de água doce são vulneráveis à poluição e ao mesmo tempo tem elevada taxa de reprodução o que lhes permite responder rapidamente à mudança nas condições ambientais sharov 2008 7

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o desenvolvimento das atividades agrícolas e industriais tem conduzido à síntese de compostos químicos sobretudo orgânicos cujas configurações estruturais envolvem átomos ou grupos funcionais raramente ou nunca encontrados na natureza zagatto e bertoletti 2006 uma vez introduzidos no ambiente tais compostos denominados xenobióticos podem se tornar poluentes caso produzam efeitos indesejáveis em consequência de sua concentração e toxicidade qualquer composto encontrado na natureza acima de seus limites normais caracteriza-se como contaminante e no momento em que tais níveis propiciem prejuízo a qualquer recurso ambiental ele passa a ser considerado um poluente zagatto e bertoletti 2006 ao atingirem o ambiente aquático estes compostos passam por processos de transporte e transformação podendo ser adsorvidos no sedimento dissolvidos na água ou podem ser perdidos para outros compartimentos ambientais por volatilização podem ainda sofrer reações químicas como hidrólise oxidação ou fotólise bem como ser biodegradados ou sofrer especiação com formação de novas espécies químicas além disso estes compostos frequentemente podem se acumular em organismos após a sua introdução no ambiente zagatto e bertoletti 2006 a assimilação e a retenção de um contaminante por um organismo pode ocorrer por absorção direta a partir do ambiente ou por ingestão de alimento contaminado possibilitando que os contaminantes possam ser transferidos de um nível trófico a outro na cadeia alimentar aumentando a probabilidade de causar efeitos deletérios zagatto e bertoletti 2006 por outro lado estes organismos bioacumuladores podem ser potenciais filtros biológicos para descontaminação de ambientes degradados como por exemplo no cultivo massivo de microalgas para descontaminação de efluentes industriais alternativamente à bioacumulação a biodegradação também é um processo com potencial utilização biotecnológica neste caso podem ocorrer mudanças relativamente pequenas na molécula original como substituição ou modificação de um grupo funcional ou mesmo a completa destruição do composto tendo como resultado final a formação de co2 h2o 8

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e sais orgânicos geralmente os produtos da biodegradação são formas moleculares que tendem a ocorrer na natureza zagatto e bertoletti 2006 a biodegradação já foi descrita para vários pesticidas incluindo o carbofurano felsot 1989 head et al 1992 megharaj et al 1994 hussain et al 2007 cáceres et al 2008 o carbofurano é um composto utilizado mundialmente pertencente à classe dos inseticidas cupinicidas acaricidas e nematicidas encontra-se no grupo químico metilcarbamato de benzofuranila e apresenta a fórmula molecular c12h15no3 figura 1 podendo ser empregado em aplicações no solo nas culturas de algodão amendoim arroz banana batata café cana-deaçúcar cenoura feijão fumo milho repolho tomate e trigo anvisa no rio grande do sul o arroz é comumente cultivado e ocupa atualmente cerca de 1,105 milhão de hectares com uma produção total de 8 milhões de toneladas representando uma produtividade média de 8.000 kg ha-1 irga 2010 nesta cultura o uso de agrotóxicos para controle de pragas é rotineiro incluindo o carbofurano este inseticida é facilmente lavado das folhas e do solo podendo entrar em contato com os ecossistemas de água doce através da dispersão dos produtos pulverizados lixiviação escoamento superficial ou derramamentos acidentais e apresenta riscos potenciais para a flora e fauna aquáticas o carbofurano é relativamente solúvel em água e hidrolisado com facilidade em meio básico formando dióxido de carbono 7 hidroxicarbofurano e metilamina peixoto 2007 o principal metabólito do carbofurano formado tanto por ação de plantas quanto microorganismos é um produto de oxidação o 3-hidroxicarbofurano que também pode sofrer outras transformações e ser eliminado por volatilização ou sofrer conjugações no ambiente a permanência do carbofurano é controlada por processos de degradação que dependendo do meio solo planta ou água pode ser química ou biológica É altamente tóxico para peixes pássaros e humanos sendo a sua ingestão diária aceitável de até 0,002 mg/kg/dia moreira et al 2004 a toxicidade do carbofurano está principalmente ligada à inibição da atividade de acetilcolinesterase enzima que degrada a acetilcolina neurotransmissor em sinapses 9

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colinérgicas a inibição de acetilcolinesterase causa uma acumulação de acetilcolina nas fendas sinápticas ocorrendo alterações no sistema nervoso fmc 1976 portanto para tentar evitar a contaminação ambiental e seus efeitos indesejáveis na biota causados pelo descontrole no uso dos agrotóxicos criou-se a legislação federal brasileira para agrotóxicos onde estes só poderão ser produzidos manipulados importados exportados comercializados e utilizados no território nacional se previamente registrados no órgão federal competente atendidas as diretrizes e exigências dos órgãos federais responsáveis pelos setores de agricultura saúde e meio ambiente o decreto federal nº 4074/2002 brasil 2002 da lei federal 7802/1989 reza que parte integrante do registro de qualquer produto novo e para reavaliação dos já existentes no mercado o ministério da saúde através da agencia nacional de vigilância sanitária anvisa deverá realizar uma avaliação toxicológica do produto baseada na portaria nº 03/ms/snvs de 16/01/1992 brasil 1992 outro requisito é a avaliação de risco ambiental dos agrotóxicos estabelecendo suas classificações quanto ao potencial de periculosidade ambiental cabe ao ministério do meio ambiente através do instituto brasileiro de meio ambiente e recursos renováveis ibama com o uso da portaria nº 84 15/10/1996 fazer esta análise brasil 1996 o registro do agrotóxico é então efetuado pelo ministério da agricultura pecuária e abastecimento mapa segundo grützmacher 2008 o canal são gonçalo e o rio piratini apresentam níveis de carbofurano acima do normal em determinadas épocas do ano principalmente nos meses de janeiro e fevereiro que é o período em que ocorrem as aplicações deste agrotóxico nas lavouras de arroz Águas localizadas em pontos com menores altitudes como as próximas do laranjal pelotas rs apresentam maiores quantidades de resíduos de agrotóxicos isto porque o escoamento ocorre em direção a estas regiões mais baixas concentrando a maior parte destes resíduos o controle de agrotóxicos poluentes é de grande importância porque eles são tóxicos e recalcitrantes várias técnicas de descontaminação estão disponíveis para a remoção de 10

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contaminantes embora nem todos sejam eficientes o suficiente para destruir estes compostos os microorganismos desempenham um papel importante na desintoxicação de compostos xenobióticos e podem degradar estes contaminantes para produtos naturais principalmente co2 e h2o o uso de microorganismos para biorremediação de agrotóxicos de sítios contaminados pode revelar-se uma alternativa viável de descontaminação sem a necessidade de métodos químicos e físicos porque uma grande variedade de microorganismos é conhecida por utilizar pesticidas como sua única fonte de energia de carbono jiang et al 2007 muitos estudos são publicados na literatura sobre a degradação de pesticidas com enfoque em bactérias há vários relatos sobre biodegradação do carbofurano e seus metabólitos por células microbianas incluindo cepas como achromonobacter flavobacterium sphingomonas arthrobacter pseudomonas chaudhry e ali 1988 tomasek e karns 1989 ramanand et al 1991 chapalmandugu e chaudhry 1992 chaudhry et al 2002 mucor ramanians e actinomycetes jiyoung et al 2007 no entanto quando este processo se refere a algas encontra-se uma grande carência de estudos que ajudem a compreender melhor a forma como estes organismos atuam no ecossistema visto que o fitoplâncton é a base da cadeia alimentar e importante para manter o equilíbrio de ambos ambientes aquáticos e terrestres portanto existe a necessidade de investigar não apenas a influencia do carbofurano sobre o fitoplâncton mas também o comportamento destas microalgas em relação à degradação e metabolização deste pesticida 11

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2 objetivo o objetivo geral deste trabalho foi avaliar a capacidade de degradação bem como a toxicidade do carbofurano para cinco espécies fitoplanctônicas dulcícolas subtropicais os objetivos específicos foram os seguintes determinar parâmetros de crescimento de cada microalga como rendimento total taxa de crescimento e período para duplicação da biomassa em diferentes concentrações de carbofurano determinar parâmetros toxicológicos do carbofurano como percentual de inibição ec50 e sensibilidade para cada microalga avaliar o percentual de degradação do carbofurano durante o crescimento de cada microalga 12

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3 artigo a ser submetido ao periÓdico journal of phycology fator de impacto 2 239 avaliaÇÃo da toxicidade e degradaÇÃo do carbofurano por cinco espÉcies fitoplanctÔnicas dulcÍcolas subtropicais bicho m s.1 silveira s b.2 primel e g.3 caldas s s.4 giroldo d.5 1 programa de pós-graduação em biologia dos ambientes aquáticos continentais instituto de ciências biológicas universidade federal de rio grande av itália km 8 rio grande rs brasil 96201-900 mbicho_01@yahoo.com.br 2 programa de pós-graduação em biologia dos ambientes aquáticos continentais instituto de ciências biológicas universidade federal de rio grande av itália km 8 rio grande rs brasil 96201-900 3 laboratório de análise de compostos orgânicos e metais escola de química e alimentos universidade federal de rio grande av itália km 8 rio grande rs brasil 96201-900 4 laboratório de análise de compostos orgânicos e metais escola de química e alimentos universidade federal de rio grande av itália km 8 rio grande rs brasil 96201-900 5 laboratório de botânica criptogâmica instituto de ciências biológicas universidade federal de rio grande av itália km 8 rio grande rs brasil 96201-900 dmbgirol@furg.br 13

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abstract pesticides such as insecticides have risen public concerning on their uncontrolled use carbofuran is a broad spectra worldwide used insecticide whose toxicity for the phytoplankton has been scarcely studied as well as its potential degradation this work aims to evaluate the carbofuran influence on the growth of five subtropical freshwater phytoplanktonic strains as well as the degradation of this pesticide by microalgae experimental cultures of desmodesmus communis cosmarium depressum var planctonicum pediastrum boryanum spondylosium pygmaeum and xanthidium antilopaeum were prepared with six carbofuran concentration 10 100 500 1,000 5,000 and 10,000 mg/l also two controls were prepared to measure the regular growth of each microalgae and the non-biological degradation processes cultures triplicates were maintained for approximately 13 days in order to determine both growth and toxicological parameters besides we evaluated the carbofuran concentration by mass spectrometry lc-esi-ms/ms in the beginning and in the end of the experiment we found significant differences in the growth of high concentration carbofuran exposed cultures for four strains and only p boryanum showed no growth inhibition d communis and x antilopaeum showed growth enhancement in intermediary carbofuran concentrations probably related to the metabolization of this pesticide which has been only reported to bacteria before all strains were able to degrade almost 100 of the added carbofuran while the non-biological degradation was up to 50 carbofuran degradation was only demonstrated before by bacteria and fungi species our data showed for the first time carbofuran degradation by phytoplanktonic strains keywords insecticide microalgae cultivation biodegradation inhibition 14

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3.1 introduÇÃo as alterações dos ecossistemas de água doce por atividades humanas têm sido motivo de preocupação frequente a necessidade de aumento na produtividade de sistemas agrícolas conduz à síntese de compostos químicos sobretudo orgânicos cujas configurações estruturais envolvem átomos ou grupos funcionais raramente ou nunca encontrados na natureza zagatto e bertoletti 2006 uma vez introduzidos no ambiente tais compostos denominados xenobióticos podem se tornar poluentes caso produzam efeitos indesejáveis em consequência de sua concentração e toxicidade os principais produtos utilizados comercialmente são compostos sintéticos com alta atividade biológica e geralmente tóxicos o carbofurano é um inseticida do grupo químico metilcarbamato de benzofuranila empregado mundialmente e aplicado no brasil em culturas de algodão arroz banana fumo milho entre outros anvisa este inseticida é facilmente lavado das folhas e do solo podendo entrar em contato com os ecossistemas de água doce através da dispersão dos produtos pulverizados lixiviação escoamento superficial ou derramamentos acidentais e apresenta riscos potenciais para a flora e fauna aquáticas ma et al 2006 no ambiente a permanência do carbofurano é controlada por processos de degradação que dependendo do meio solo planta ou água pode ser química ou biológica É altamente tóxico para peixes pássaros e humanos sendo a sua ingestão diária aceitável de até 0,002 mg/kg/dia moreira et al 2004 sistemas subtropicais brasileiros de água doce como o manancial da cidade de rio grande canal são gonçalo apresentam níveis de carbofurano acima do normal em determinadas épocas do ano principalmente nos meses de janeiro e fevereiro que é o período em que ocorrem as aplicações deste agrotóxico nas lavouras de arroz grützmacher 2008 o controle de agrotóxicos é de grande importância por isso diversas técnicas de descontaminação estão disponíveis para a remoção destes contaminantes embora nem todos sejam eficientes o suficiente para destruir estes compostos os microorganismos desempenham 15

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