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1 resumo nesta monografia é apresentada uma revisão bibliográfica sobre as lipases enfocando suas diversas aplicações devido ao seu enorme potencial em processos industriais as enzimas já são utilizadas pelo homem empiricamente há milhares de anos em aplicações práticas até serem elucidados o modo de ação destes notáveis catalisadores biológicos atualmente já se conhecem muitas enzimas e algumas delas são provenientes de bactérias fungos filamentosos e leveduras sendo que 75 destas enzimas são as lipases que já estão sendo comercializadas com o aumento de enzimas conhecidas criou-se a um sistema para nomeá-las e numerá-las dividindo-as em seis classes de acordo com o tipo de reação catalisada devido as ambigüidades geradas as lipases são da classe das hidrolases e são solúveis em água agem peculiarmente na interface orgânico-aquosa o que as tornam catalisadoras enzimáticas especializadas utilizadas em processos de biotransformações de óleos e gorduras em diversas aplicações e finalidades industriais dentre outras estas enzimas são bastante seletivas e favorecem energeticamente a rota da reação através da catálise enzimática seu sítio ativo liga ao substrato formando produtos através da formação do complexo enzima-substrato diminuindo assim a barreira energética entre reagentes e produtos as lipases microbianas são em sua maioria produzidas fora da celula ou seja extracelulares o que facilita sua extração isolamento e purificação através da catálise em meio orgânico elas transferem o grupo acila para variáveis compostas de aceptores diferentes da água alguns fatores podem afetar a velocidade das reações e impedirem que as enzimas sejam 1

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reutilizadas ou até mesmo inativá-las irreversívelmente fatores tais como inibidores ou ativadores ph e temperatura do meio reacional podem acarretar desvios de linearidade na molécula da enzima e conseqüentemente na sua função tornando-as inviáveis lipases catalisam reações que geralmente são controladas pelo conteúdo de água no meio reacional como da hidrólise de sua síntese reversa ou esterificação e a de interesterificação sob condições restritas de água em reações resultantes de concorrentes da hidrólise e esterificação é minimizada a hidrólise da gordura mantendo dominante a reação de interesterificação lipases estão sendo utilizadas em técnicas de imobilização o que permite seu melhoramento e sua reciclagem propiciando maior estabilidade entre elas e as celulas transformado-as em catalisadores heterogêneos as enzimas quando fisicamente confinadas ou localizadas em regiões definidas do espaço podem ser reutilizadas como quando proposta na primeira conferência em engenharia de enzimas devido a este enorme potencial aplicativo em inúmeras atividades intensificaram-se as pesquisas englobando lípases É importante que haja cada vez mais pesquisas incluindo a seleção de novas linhagens produtoras e sua otimização relacionadas com esses biocatalisadores naturais devido ao fato de minimizarem o impacto ambiental por não gerarem quantidades significativas de resíduos poluentes ao meio ambiente tornando-os tão atrativos industrialmente e de grande relevância nos dias atuais 2

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2 objetivo o objetivo desta monografia é fazer uma breve revisão bibliográfica sobre as lipases estas notáveis e promissoras enzimas devido a sua ampla aplicabilidade seletividade alta especificidade ao substrato e ao seu grande potencial para diversos fins e em diversas aplicações em processos industriais 3

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3 introduÇÃo as enzimas são utilizadas em diversos processos industriais principalmente na indústria alimentícia química farmacêutica dentre outras uma das principais enzimas utilizadas industrialmente são as lipases que hidrolisam óleos e gorduras na interface orgânico-aquosa as lipases são aplicadas em diversos processos industriais dentre eles a modificação de óleos e gorduras na indústria óleo-química na indústria têxtil a enzima melhora a qualidade e as propriedades de tecidos na indústria alimentícia são usadas para melhorar o sabor de alimentos como na fermentação de salames e vinhos são utilizadas na produção de aditivos alimentares como ácidos graxos poliinsaturados e na indústria de detergentes para a remoção de manchas de difícil remoção devido ao grande potencial na utilização das lipases vêm aumentando gradativamente pesquisas englobando seu isolamento como também a seleção de novas linhagens produtoras levando ao aumentando no seus estudos na otimização da produção e na utilização da enzima imobilizada 4

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4 revisÃo de literatura 4.1 enzimas 4.1.1 histÓrico o homem vem utilizando as enzimas empiricamente há milhares de anos em diversos processos tais como a fermentação do suco de uva para a obtenção do vinho na fabricação de pães e queijos porém eram apenas aplicações práticas por não conhecerem o modo de ação destes catalisadores biológicos que só foi elucidado muito tempo depois nelson cox 2002 grande parte da história das enzimas coincide com a da bioquímica o estudo das enzimas foi inicialmente reconhecido no séc xvii a partir de estudos sobre a digestão de alimentos por secreções do estômago e posteriormente com pesquisas da conversão de amido em açúcares simples utilizando saliva e vários extratos vegetais jean baptista van helmont considerava a transformação dos alimentos um processo químico mediado por fermentos lazzaro spallanzani demonstrou que o suco gástrico continha um princípio capaz de digerir a carne dalla-vecchia et al 2004 nelson cox 2002 vários cientistas se destacaram e propiciaram o progresso da bioquímica como gustav robert kirchoff que em 1814 utilizando extrato de trigo demonstrou o fenômeno da conversão do amido em açúcar já em 1833 anselme payen e jean françois persoz demonstraram a conversão do malte em extrato etanólico tipton boyce 2000 em 1850 louis pasteur descobriu que as leveduras catalisavam a fermentação do açúcar em álcool e postulou que as leveduras eram 5

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fermentos na mesma época justus von liebig defendia idéias opostas às de pasteur para ele os processos fermentativos eram reações químicas em 1876 w frederick kühne sugeriu o termo enzima que vem do grego e significa na levedura acreditando que este tipo de catalisador só atuava dentro da célula tipton boyce 2000 em 1897 eduard buchner finalizou a polêmica entre pasteur e liebig descobrindo que extratos de levedura fermentavam o açúcar produzindo álcool e mesmo que as células fossem removidas do meio de cultura o processo continuava devido à existência de enzimas nelson cox 2002 tipton boyce 2000 a partir dos estudos envolvendo o isolamento e a cristalização da urease por james sumner 1926 foi postulado que toda enzima é uma proteína proporcionando um grande avanço nos estudos que envolvem enzimas dalla-vecchia et al 2004 essa premissa permaneceu controvertida durante algum tempo até ser completamente aceita após john northrop e moses kunitz em 1930 terem cristalizado a pepsina tripsina e outras enzimas envolvidas no processo da digestão concluindo que estas também eram proteínas nelson cox 2002 neste mesmo período j b s haldane sugeriu que as interações estabelecidas entre a enzima e o substrato seriam fracas e que mesmo distorcendo a molécula do substrato a reação continuava sendo catalisada representando um importante passo para a elucidação da catálise enzimática as pesquisas nesta área intensificaram-se no final do séc xx com a 6

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purificação e a compreensão sobre o funcionamento do mecanismo químico a estrutura molecular e a ação de várias enzimas nelson cox 2002 4.1.2 visÃo geral para a existência da vida são necessárias certas condições fundamentais para realizar todas as suas atividades como por exemplo movimentar-se alimentar-se e reproduzir-se o organismo deve ser capaz de utilizar a energia do meio ambiente como combustível e de produzir descendentes nelson cox 2002 quantidades substanciais de fontes de carbono na forma de polissacarídeos consumidas como alimentos são convertidas em açúcares simples tais como glicose frutose e maltose produzindo energia para o organismo embora alguns processos liberem energia química em segundos como por exemplo quando se consome sacarose outros tendem a ser mais lentos não-catalisados mesmo que termicamente favoráveis como por exemplo no caso do armazenamento do açúcar que pode levar vários anos até que a sacarose se converta em gás carbônico e água na presença de oxigênio tornando a vida insustentável por não ocorrer com velocidade adequada nelson cox 2002 a diferença está na catálise que sustenta a vida em tempo hábil e acelera as reações químicas nos sistemas biológicos com eficiência as mais notáveis e altamente especializadas proteínas catalisadoras são as enzimas que aceleram as reações químicas e em geral são mais eficientes do que os catalisadores sintéticos ou inorgânicos por terem grande especificidade pelo 7

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substrato e por funcionarem em soluções aquosas sob condições brandas de temperatura e ph visto que apenas um número limitado de catalisadores possuem tais propriedades relevantes em todos os processos bioquímicos champe harvey 1996 nelson cox 2002 as enzimas são unidades funcionais do metabolismo celular e são encontradas em microrganismos vegetais e animais são de natureza protéica e são formadas por subunidades ou aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas nelson cox 2002 atuando em sequências organizadas catalisando centenas de reações em etapas através das quais as moléculas de nutrientes são degradadas e as macromoléculas são formadas através de precursores simples de forma que a energia química da catálise possa ser conservada e transformada equilibrando as atividades nos sistemas biológicos nelson cox 2002 as enzimas estão presentes em todas as células em pequenas quantidades acelerando a velocidade de uma reação química sem serem alteradas no processo permanecendo intactas no final de cada reação champe harvey 1996 a maioria das enzimas são proteínas exceto um pequeno grupo de moléculas de rna catalítico chamadas ribozimas a atividade de catálise depende da integridade da conformação protéica nativa ou seja se uma enzima é dissociada em subunidades ou submetida à desnaturação tende-se a perdê-la e quando ocorre a quebra em seus aminoácidos sua atividade é perdida portanto a integridade das estruturas desde a primária até a 8

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quaternária são fundamentais para manter a atividade catalítica dallavecchia et al 2004 nelson cox 2002 o peso molecular das enzimas pode variar de 12.000 a mais de um milhão de daltons da algumas podem ser modificadas através de ligação covalente por processos como fosforilação e glicosilação entre outros envolvidos na regulação da atividade enzimática nelson cox 2002 nem toda enzima necessita de um grupo químico além dos resíduos de seus aminoácidos outras requerem a presença de co-fatores que podem ser uma molécula orgânica complexa ou metalorgânica coenzima e/ou um ou mais íons inorgânicos fe2 mg2 mn2 ou zn2 para concluir sua atividade enzimática denomina-se grupo prostético quando a parte protéica de uma enzima está ligada fortemente ou covalentemente a coenzima e/ou um íon metálico a coenzima e/ou íons metálicos ligados a uma enzima denomina-se holoenzima sendo a parte protéica dessa enzima chamada apoenzima ou apoproteína nelson cox 2002 sant`anna jr 2001 4.1.3 nomenclatura inicialmente as enzimas eram identificadas pelo nome do seu descobridor porém com o aumento da quantidade de enzimas conhecidas houve a necessidade da criação de uma nomenclatura sistemática que indicasse a ação específica de cada enzima e os substratos sobre os quais atua assim em 1955 a união internacional de bioquímica estabeleceu a 9

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comissão de nomenclatura e classificação de enzimas para esta finalidade champe harvey 1996 kieling 2002 sant`anna jr 2001 de acordo com a nomenclatura utilizada cada enzima recebe dois nomes um para o uso no dia-a-dia que é o nome recomendado e outro mais complexo o nome sistemático o nome recomendado é composto de três partes o substrato preferente o tipo de reação catalisada e a terminação ase o nome sistemático é utilizado quando a enzima deve ser identificada sem ambigüidade neste caso utiliza-se o sufixo ase unido a uma descrição da reação química catalisada ou ao nome do substrato champe harvey 1996 kieling 2002 sant`ann a jr 2001 por intermédio do acordo internacional o sistema criado para nomear e classificar as enzimas é dividido em seis classes principais com subclasses de acordo com o tipo de reação catalisada conforme apresentado na tabela 1 champe harvey 1996 kieling 2002 nelson cox 2002 sant`anna jr 2001 10

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tabela 1 classificação de enzimas segundo a união internacional de bioquímica e biologia molecular iubmb castro anderson 1995 kieling 2002 sant anna jr 2001 nelson cox,2002 queiroz 2002 classe de enzimas 1.oxidoredutases algumas subclasses hidrogenases oxidases peroxidases reações catalisadas pelas enzimas reação de oxidação-redução ou transferência de elétrons íons hidretos ou átomos de hidrogênio atuando em ch-oh c=o c=o ch-nh nadh e nadph reações de transferência de grupos funcionais entre moléculas grupos com 1c aldeído ou cetona acil glicosil fosfatos e enxofre reações de hidrólise ésteres ligações glicosídicas peptídicas outras ligações c-n e anidridos ácidos transferência de grupos funcionais para a água catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água amônia e gás carbônico c=c =c=o =c=n transferência de grupos dentro da mesma molécula para formar isômeros catalisam reações de formação de novas moléculas a partir da ligação entre duas pré-existentes à custa de energia c-o c-s c-n c-c 2 transferases transaldolases transcetolases 3 hidrolases esterases lipases peptidases 4 liases descarboxilases cetoácidoliases 5 isomerases racemases epimerases mutases sintetases 6 ligases 11

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através deste acordo internacional além dos nomes recomendado e sistemático criou-se um método para numerar as enzimas cada enzima possui um dígito específico e são identificada pelas letras e.c enzyme commission seguidas por um código numérico composto de quatro dígitos separados por pontos e um nome sistemático identificando o tipo de reação catalisada cada enzima possui um código com 4 dígitos conforme observado abaixo nelson cox 2002 sant`anna jr 2001 tipton boyce 2000 1º dígito classe 2º dígito subclasse 3º dígito sub-subclasse 4º dígito substrato podemos exemplificar com a enzima hexoquinase nome trivial que catalisa a reação abaixo atp d-glicose adp d-glicose-6-fosfato ela é uma atp-glicose fosfotransferase que transfere cataliticamente um grupo fosfato do atp para a glicose o número desta enzima na comissão é e.c 2.7.1.1 sendo o primeiro dígito indicador da classe a qual pertence a enzima neste caso o número 2 e refere-se a uma transferase o segundo dígito se refere à subclasse dentro de cada classe o 7 se refere a uma fosfotransferase o terceiro se refere à sub-subclasse no caso uma fosfotransferase que apresenta um grupo hidroxila aceptor de fosfato o quarto é o dígito usado para identificar individualmente a enzima ou quem é o aceptor do grupo e neste caso o dígito 1 indica que a d-glicose é o aceptor do grupo 12

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fosfato nelson cox 2002 sant`anna jr 2001 tipton boyce 2000 4.1.4 propriedades as enzimas são bastante específicas nas transformações moleculares apresentam alguns tipos de especificidade como absoluta em grupo de ligação e estereoquímica gonÇalves 2007 queiroz 2002 a especificidade absoluta ocorre quando a enzima catalisa apenas uma reação em particular na especificidade em grupo a enzima dirige a ação catalítica para um grupo funcional específico na molécula do substrato como por exemplo distinguir o grupo hidroxila oh e na especificidade estereoquímica a enzima atua sobre um tipo particular de isômero óptico ou estéreo na especificidade de ligação as enzimas atuam sobre um tipo particular de ligação química da estrutura molecular como é o caso de algumas que só catalisam a hidrólise de ligações peptídicas e outras a hidrólise de ligações éster gonÇalves 2007 queiroz 2002 sant`anna jr 2001 4.1.5 ­ mecanismo de aÇÃo o funcionamento enzimático aborda a catálise durante a reação alterando e favorecendo energeticamente a rota de reação alternativa diferentemente das reações não-catalisadas o sítio ativo da molécula enzimática liga-se ao substrato facilitando quimicamente a catálise champe harvey 1996 13

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as reações químicas possuem uma barreira energética que separa a energia dos substratos e um intermediário de alta energia que ocorre durante a formação do produto denominada energia livre de ativação este pico de energia representa a transição na qual um intermediário se forma durante a conversão do substrato ao produto devido à energia livre de ativação as velocidades das reações químicas não-catalisadas são mais lentas do que as das reações catalisadas a velocidade da reação varia de acordo com a quantidade de moléculas energizadas ou seja quanto menor a energia livre de ativação mais moléculas têm energia suficiente para superar o estado de transição tornando mais rápida a velocidade de reação na ausência de uma enzima apenas uma pequena proporção da população de moléculas deve conter energia suficiente para atingir o estado de transição entre substrato e produto champe harvey 1996 na etapa inicial da catálise enzimática ocorre a formação de um complexo enzima-substrato es o substrato liga-se a uma região específica da enzima chamada de sítio ativo contendo os radicais ou grupamentos catalíticos de aminoácidos que participam da quebra de ligações as enzimas reagem através da formação do complexo enzima-substrato para formarem os produtos carli 2006 champe harvey 1996 para exemplificar podemos citar a transformação da sacarose substrato em dois produtos glicose e frutose sendo esta reação catalisada pela enzima invertase como pode ser observado na figura 1 a catálise enzimática pode ser facilmente entendida através do modelo ilustrativo do mecanismo da chave fechadura proposto por emil fisher 14

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em 1894 conforme observado na figura 2 e do mecanismo do encaixe induzido de koshland jr desenvolvido no final dos anos 60 queiroz 2002 carli 2006 a hipótese da chave e fechadura diz que a especificidade de uma enzima representando a fechadura e do seu substrato representado pela chave provém da complementaridade das suas respectivas configurações se houver alterações na forma tridimensional de uma enzima esta deixará de funcionar pois não ocorrerá o encaixe dos substratos no sítio ativo já o modelo do mecanismo do encaixe induzido proposto por koshland jr prevê um sítio de ligação não totalmente pré-formado mas sim moldável à molécula do substrato ajustando a enzima ao substrato carli 2006 queiroz 2002 nas reações catalíticas as enzimas aceleram a velocidade da reação e diminuem a barreira energética entre reagentes e produtos que ocorrem por elas atraírem em orientações favoráveis os substratos no complexo enzima-substrato es carli 2006 queiroz 2002 15

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