VetScience Magazine N˚Especial - Molecular Services

 

Embed or link this publication

Description

www.vetsciencemagazine.com.br

Popular Pages


p. 1

ISSN 2358-5145 um benefício para o cliente TECSA MAGAZINE Número Especial MOLECULAR SERVICES UMA ESPECIALIDADE TECSA LABORATÓRIOS www.vetsciencemagazine.com.br 1

[close]

p. 2

PCr real time uma especialidade TECSA INCORPORE ESTE EXAME EM SUA ROTINA E GARANTA QUALIDADE E EFICIÊNCIA AINDA MAIORES. Vantagens PCR Real Time TECSA LaboraTOrios: O PCR Real Time é uma excelente ferramenta diagnóstica na detecção e quantificação de porções específicas do material genético de diversos agentes patogênicos. Além de garantir um diagnóstico respaldado pela ausência de reações cruzadas, o monitoramento da carga parasitaria/viral dita o real prognóstico do animal e permite ainda avaliar a eficácia do tratamento.

[close]

p. 3

EDITORIAL Real time PCR - Aplicações no dia a dia em Medicina Veterinária Dentre as maiores conquistas da ciência nas últimas décadas, o desenvolvimento e aprimoramento das técnicas de biologia molecular possuem notório destaque. Um dos maiores marcos foi a descrição do processo de reação em cadeia da polimerase (PCR), que atualmente é uma das técnicas mais utilizadas em laboratórios da área de saúde. Com o passar dos anos, a técnica de PCR convencional foi sendo aprimorada, sendo então desenvolvida a Real Time PCR (qPCR), que realiza não só a detecção como a quantificação do material genético. Este método representa mais um grande avanço no setor, trazendo consigo resultados mais sensíveis, específicos e de maior reprodutibilidade. Vantagens da Real Time PCR Os métodos moleculares detectam fragmentos específicos de ácidos nucléicos (DNA/RNA) no material analisado. Com a técnica, é possível realizar a ampliação in vitro de qualquer fragmento de DNA ou RNA, partindo de uma pequena quantidade de material genético. A qPCR possui várias vantagens sobre a PCR convencional, que facilitam o diagnóstico do paciente. Além de ser possível quantificar o material genético na amostra, a técnica requer concentrações muito menores de material genético; o tempo de reação é reduzido; há maior reprodutibilidade, sensibilidade e precisão; o risco de contaminação é mínimo e há a possibilidade de detecção de mais de um patógeno por vez (qPCR Multiplex). Quantificação A quantificação da amostra é um dos maiores diferenciais da qPCR, pois com ela tornou-se possível informar qual a quantidade de material genético contido na amostra (figura 1). Essa informação pode auxiliar na diferenciação por interferência de vírus atenuados vacinais ou se realmente se trata de uma infecção natural. Além disso, podese também estabelecer o monitoramento infeccioso, estimar o prognóstico e a eficácia terapêutica, levando em consideração a quantidade inicial do material genético detectado. Contaminação A contaminação na qPCR é mínima, uma vez que a reação ocorre dentro de um tubo fechado, sem a necessidade de manipulação do material e ausência de processamento pós-amplificação, fazendo com que o risco de contaminação diminua significativamente quando comparado à PCR convencional. Detecção de patógenos Uma das características da qPCR é a possibilidade de detectar mais de um patógeno por amostra (qPCR Mutiplex), através de painéis diagnósticos elaborados, que abrangem um grande número de agentes. Essa característica pode ser explorada quando há diferentes suspeitas de diagnóstico devido a um quadro clínico semelhante à várias doenças. Ao se investigar vários patógenos simultaneamente, além da diminuição no tempo de diagnóstico, há a possibilidade de se investigar coinfecções, o que reduz os custos de forma considerável comparados com a realização individual dos mesmos exames. Os testes sorológicos são baseados nos níveis de anticorpos existentes na circulação do animal, que se elevam devido a anticorpos maternais, infecções naturais (agudas ou crônicas) ou por vacinações. Esses testes são amplamente usados na rotina, auxiliando a elucidar casos de infecções, porém, é importante saber alguns pontos críticos existentes em sua utilização.

[close]

p. 4

NOVO SETOR TECSA MOLECULAR SERVICES Figura 1: Real Time PCR. Fonte: http://www.fleury.com.br/medicos/educacao-medica/manuais/manual-hematologia/pages/pcr.aspx. Ao realizar a solicitação de um exame sorológico para uma determinada doença, é preciso ter em mente alguns pontos, como se a suspeita é de uma infecção aguda (IgM) ou crônica (IgG); se a imunidade do animal está suficiente para gerar uma resposta contra o antígeno; se o resultado positivo teve alguma reação cruzada com alguma outra doença e se os níveis elevados de IgG são realmente devidos à doença ativa (ou se é apenas memória imunológica). Caso seja preciso repetir o exame por motivos inconclusivos, é preciso esperar algumas semanas para refazer o reteste, a fim do sistema imune possa gerar algum tipo de resposta. Desta forma, observa-se que a qPCR possui vantagens também sobre a sorologia, devido ao fato de que é realizada a detecção direta e mensuração do material genético e não da resposta humoral, podendo-se identificar a infecção antes mesmo do organismo produzir anticorpos contra a doença. Além disso, a qPCR é extremamente específica, sem riscos de reações cruzadas como observado para os exames sorológicos. Um ponto importante a ser destacado é que em infecções crônicas (onde o nível de antígeno está muito baixo), a sorologia poderá se sobressair ou ser considerada como ferramenta auxiliar, pois irá evidenciar a resposta imune relacionada com o patógeno tido como responsável pela suspeita clínica. Por sua vez, a qPCR pode não identificar o antígeno em animais cronicamente infectados, devido ao tempo e a diminuição significativa dele no organismo. Desta forma, a qPCR é uma ferramenta com maior aplicabilidade no diagnóstico de doenças em fase aguda. O esfregaço sanguíneo é utilizado na clínica veterinária para detectar hemoparasitas, doenças virais (corpusculos de inclusão), doenças bacterianas e fúngicas de forma direta na lâmina. Porém, este exame é pouco sensível e podem ocorrer muitos resultados falso-negativos. Comparativamente, ao se pesquisar hemoparasitas em um esfregaço, é necessário existir cerca de 1000 parasitas/µL de sangue, já na detecção através da qPCR, é necessário apenas 1 parasita/µL de sangue. Além disso, o resultado do esfregaço está intimamente ligado a qualidade da coleta, da fase clínica do processo infeccioso, da amosta e da experiência do patologista. Outro ponto negativo do esfregaço sanguineo é a dificuldade (ou até impossibiliade) de se identificar as diferentes espécies do mesmo gênero de hemoparasias através apenas da morfologia. Por sua vez, com a ajuda da qPCR, não só é possível identficar o gênero e a espécie, como também quantificar sua presença na amostra. Sem dúvida alguma, a qPCR é uma poderosa ferramenta para auxiliar na determinação de diagnósticos, devido às suas inúmeras vantagens aqui discutidas. É importante destacar que os exames de rotina são de grande importância diagnóstica e funcional para o dia a dia na clínica veterinária, e que o qPCR veio para somar forças, uma vez que possui o mesmo objetivo destes exames, que é o de sempre auxiliar o Médico Veterinário a concluir seus diagnósticos com êxito. Luiz Eduardo Ristow Diretor Presidente Dr. Otávio Valério de Carvalho MV- Phd em Virologia Molecular Diretor Técnico

[close]

p. 5

ÍNDICE 06.BIOLOGIA MOLECULAR 06. ACOMPANHAMENTO DA EFICÁCIA DE TRATAMENTO PELO PCR REAL TIME DIAGNÓSTICO QUANTITATIVO PARA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA 07. CINOMOSE: DIAGNÓSTICO LABORATORIAL POR MEIO DA TÉCNICA PCR REAL TIME 09. ERLIQUIOSE CANINA E FELINA - DIAGNÓSTICO POR PCR REAL TIME 11. COMPARAÇÃO DE PCR TEMPO REAL E PCR CONVENCIONAL PARA DETECÇÃO DE LEISHMANIA  INFANTUM 13. DIAGNÓSTICO DA LEPTOSPIROSE E TOXOPLASMOSE POR PCR – REAL TIME 16. PAINÉIS FACILITADORES - CANINOS 17. PAINÉIS FACILITADORES - FELINOS 20. EXAMES INDIVIDUAIS -REAL TIME PCR 39. TESTES GENÉTICOS – BOVINOS 40. TESTES GENÉTICOS – EQUINOS 41. TESTES GENÉTICOS – BUBALINOS 42. TESTES GENÉTICOS – CANINOS E FELINOS EXPEDIENTE Editores/Publishers: Dr. Luiz Eduardo Ristow . CRMV-SP 5560S . CRMV-MG 3708 . ristow@tecsa.com.br Dr. Afonso Alvarez Perez Jr. . afonsoperez@tecsa.com.br Equipe de Médicos Veterinários TECSA . tecsa@tecsa.com.br Diagramação: Sê Comunicação . se@secomunicacao.com.br Contatos e Publicidade: comunicacao@tecsa.com.br Av. do Contorno , nº 6226 , B. Funcionários, Belo Horizonte - MG – CEP 30.110-042 PABX-(31) 3281-0500 Tiragem: 5000 revistas . Publicação Bimestral Na Internet: www.vetsciencemagazine.com.br ISSN: 2358-1018 CIRCULAÇÃO DIRIGIDA A revista VetScience® Magazine é uma publicação do Grupo TECSA dirigida somente aos médicos veterinários, como parte do Projeto JORNADA DO CONHECIMENTO, criado pelo mesmo. Este projeto visa a universalização do conhecimento em Medicina Laboratorial Veterinária. A periodicidade é Bimestral, com artigos originais de pesquisa clínica e experimental, artigos de revisão sistemática de literatura, metanálise, artigos de opinião, comunicações, imagens e cartas ao editor. Não é permitida a reprodução total ou parcial do conteúdo desta revista sem a prévia autorização do TECSA. Os editores não podem se responsabilizar pelo abuso ou má aplicação do conteúdo da revista VetScience magazine. Grupo TECSA – Referência de precisão, tecnologia e inovação desde 1994!

[close]

p. 6

BIOLOGIA MOLECULAR ACOMPANHAMENTO DA EFICÁCIA DE TRATAMENTO PELO PCR REAL TIME - DIAGNÓSTICO QUANTITATIVO PARA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA Atualmente estão disponíveis diversas metodologias para o diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC). O diagnóstico laboratorial pode ser feito através do exame parasitológico direto, por meio de métodos imunológicos: a Imunofluorescência indireta (RIFI) ou ensaios imunoenzimáticos (ELISA), por método de imuno-histoquímica e, mais recentemente, através de métodos moleculares de amplificação do ácido nucléico (PCR e PCR-Real Time). Cada metodologia tem particularidades que devem ser conhecidas pelo clínico no momento da requisição e da interpretação do exame. PCR – Reação em Cadeia de Polimerase Vários estudos demonstram que a PCR é altamente específica e mais sensível do que os métodos parasitológicos clássicos utilizados para o diagnóstico da LVC. A utilização da PCR permite a detecção do parasita com uso de sondas específicas de forma não invasiva, através da amplificação do cinetoplasto da Leishmania sp. A PCR pode ser utilizada em qualquer amostra biológica, incluindo pele, sangue, biópsia de linfonodo e medula óssea. Reações falso-negativas podem ocorrer quando a quantidade de DNA está abaixo da sensibilidade de detecção do teste.   PCR- Real Time A técnica PCR Real Time é uma categoria de PCR que permite a detecção e quantificação em tempo real de uma região específica do material genético. Para que isso ocorra, são empregadas sondas específicas para o fragmento alvo, marcadas com fluoróforos. Durante a amplificação do DNA, essas sondas se ligam ao fragmento alvo e são inativadas enzimaticamente. Ao serem inativadas, ocorre emissão de fluorescência, que é proporcional a um determinado produto da PCR. A detecção de fluorescência indica a presença ou ausência das regiões pesquisadas, de forma rápida, precisa e sensível.  Dúvidas mais freqüentes Quais as vantagens da Técnica PCR Real Time na detecção das Leishmanioses? • Monitoramento da carga parasitária: quantificação da expressão gênica em diferentes amostras biológicas. • Detecção rápida da Leishmania: graças à amplificação e à detecção simultânea dos produtos a cada ciclo realizado, a PCR Real Time representa uma significativa redução de tempo na realização nos testes moleculares. • Especificidade: no PCR Real Time para Leishmania é utilizado material genético específico desse parasita, garantindo que apenas material genético de Leishmania chagasi ( responsável pela Leishmaniose visceral ) seja alvo da reação. • Sensibilidade: a seleção da sequência alvo determina a sensibilidade e a especificidade do teste. Uma maior sensibilidade é atingida quando sequências de DNA presentes em cópias múltiplas são utilizadas, como, por exemplo, a região conservada dos minicírculos de DNA do Cinetoplasto (kDNA). O kDNA apresenta cerca de 10.000 minicírculos de DNA distribuídos em uma região conservada e uma região variável. Iniciadores específicos para amplificar esta região conservada são úteis na detecção de todas as espécies de Leishmania, enquanto aqueles direcionados para a região variável permitem a diferenciação de cada espécie ou complexo de espécies existentes. Tais particularidades fornecem maior eficiência à reação e, consequentemente, ao diagnóstico e monitoramento durante a terapêutica da leishmaniose. Quando solicitar testes moleculares por PCR Real Time na detecção das leishmanioses? A abordagem quantitativa pode ser útil no monitoramento da carga parasitária em tecidos caninos em fase de tratamento e pós-tratamento. Assim, é possível identificar recidivas da leishmaniose, acompanhar a evolução da patologia e avaliar a eficiência de um tratamento farmacológico. Consequentemente, o teste fornece informações para a otimização do tratamento e quanto ao prognóstico da infecção. O TECSA Laboratórios realiza todos os testes para um diagnóstico completo, juntamente com a avaliação do Clínico Veterinário.  Observações: • Todas as amostras devem ser coletadas em frasco estéril. • Enviar as amostras refrigeradas em até 72 horas. • A confiabilidade, especificidade e sensibilidade do teste dependem do cumprimento de todas estas recomendações. 6

[close]

p. 7

BIOLOGIA MOLECULAR CINOMOSE: DIAGNÓSTICO LABORATORIAL POR MEIO DA TÉCNICA PCR REAL TIME A Doença e sua importância A cinomose é uma doença que possui alta morbidade e mortalidade. O agente etiológico é um RNA vírus de cadeia simples que pode ser eliminado por meio de secreções respiratórias, oculares, urina, fezes e saliva mesmo na ausência de manifestações clínicas. Ressalta-se ainda, que mais de 50% das infecções são assintomáticas, determinando assim o papel de alguns animais como portadores e disseminadores por até 90 dias após infecção.O período de incubação varia de quatro a dez dias e o primeiro sinal de infecção costuma ser uma conjuntivite serosa ou mucopurulenta (figura 1), seguida de tosse seca que, com o tempo, torna-se produtiva. As lesões cutâneas incluem uma dermatite vesicular ou pustular (impetigo) e hiperqueratose nasal e dos coxins digitais. Pode ocorrer ou não o aparecimento de sinais neurológicos. Mais de 50% das infecções são provavelmente assintomáticas, ressaltando-se a necessidade de um diagnóstico preciso. Fig.1: Cão com conjuntivite mucopurulenta. Fonte: Center for veterinary Education, vetbook.org A possibilidade de se realizar um diagnóstico laboratorial ante mortem conclusivo da cinomose canina é de fundamental importância para a formulação de condutas terapêuticas mais adequadas, para a determinação do prognóstico de forma mais objetiva e para a adoção de medidas de controle e profilaxia diferenciadas e específicas, mais apropriadas para cada caso. Diagnóstico Laboratorial O diagnóstico clínico da cinomose é muitas vezes inconclusivo, portanto fazse necessário o diagnóstico diferencial com outras doenças infecciosas e parasitárias que podem apresentar um quadro semelhante tais como parvovirose, neosporose, verminose, giardíase, toxoplasmose, raiva, insuficiência hepática, encefalopatia hepática e trauma (síndrome vestibular). Exames complementares como hemograma (COD 39HEMOGRAMA COMPLETO PET E ANIMAIS SILVESTRES) e análise do liquor (COD 169 ANALISE DE LIQUOR), podem ser realizados e sugerir a infecção pelo vírus da cinomose caso sejam inconclusivos. Entretanto, para a confirmação do diagnóstico da doença são necessários testes específicos como o PCR-RT. A avaliação hematológica e do líquido cefalorraquidiano (LCR) podem sugerir a infecção pelo agente viral, entretanto a confirmação diagnóstica exige testes específicos imunodirecionados ou que apresentem alta especificidade e sensibilidade em detectar a presença do antígeno. Achados em exames hematológicos como leucopenia/leucocitose podem ser transitórios. A bioquímica sérica não apresenta alterações significativas ou características, apesar de ser de grande importância na avaliação do estado geral do paciente. A evidenciação de corpúsculos de inclusão intracitoplasmáticos (Lentz) em linfócitos também confirma o processo infeccioso (figura 2), porém os mesmos só estão presentes no sangue periférico (células vermelha e brancas) na fase inicial da infecção, dificultando assim sua confirmação apenas em pesquisa microscópica direta. Além disso, a presença de anticorpos da classe IgM e IgG também podem não ser definitiva para se fechar o diagnóstico (na ausência de informes vacinais, por exemplo ou vacinação recente). Figura 2: Inclusões de Lentz intra-eritrocitárias. Fonte: Canine Distemper, marvistavet.com. A natureza contagiosa e as altas taxas de mortalidade da cinomose tornam necessário acelerar o processo 7

[close]

p. 8

BIOLOGIA MOLECULAR de diagnóstico. Por conseguinte, um método sensível, específico e rápido é desejável para detectar inclusive pequenas quantidades de vírus no início da infecção. O PCR-RT é uma técnica molecular utilizada com o objetivo de identificar precocemente o vírus da cinomose em cães com manifestações clínicas da infecção, podendo ser realizada em sangue total (amostra em EDTA), urina, fezes, líquor, secreção conjuntival e saliva de cães suspeitosResultados positivos no sangue, nas fezes e em swabs nasais ou conjuntivais podem ser obtidos em animais assintomáticos naturalmente expostos e após vacinação com vírus atenuado. Nesses casos é importante conhecer o histórico de vacinação do animal e usar a técnica de qPCR (COD 772- CINOMOSE - METODO PCR REAL TIME QUANTITATIVO) para obter um diagnóstico acurado da doença. A qPCR permite quantificar a carga viral em diferentes tecidos e fluidos corpóreos como o sangue. É possível diferenciar um animal submetido à vacinação para cinomose com manifestações clínicas decorrentes de qualquer outra enfermidade de um cão realmente infectado pelo vírus, uma vez que durante a infecção a carga viral é exponencialmente maior. Portanto o diagnóstico preciso e precoce pode ser obtido por meio da técnica de qPCR Real Time QUANTITATIVO, diferenciando ANIMAL CUJA VACINAÇÃO FOI RECENTE DE ANIMAL INFECTADO. Tal recurso diagnóstico apresenta grande sensibilidade associada à alta especificidade, sendo capaz de detectar mínimas quantidades de partículas virais até mesmo no início da infecção, independente da duração e da apresentação clínica da doença em diferentes tecidos e fluidos corpóreos. Além disso,permite a adoção de medidas de suporte, controle e prevenção mais adequadas, determinando o prognóstico. As amostras a serem coletadas (eleição) para realização da PCR ante mortem são sangue total em EDTA e líquor (sinais inespecíficos) ou urina, fezes, secreções conjuntival e tonsilas (clínica severa). Após a morte do animal podem ser coletados fragmentos de bexiga, tonsilas e linfonodos, fixados em solução de formalina a 10% e destinados à avaliação histopatológica, evidenciandose a presença de corpúsculos de inclusão (figura 3). Figura 3: Fotomicrografia de cérebro de cão com cinomose. Notar a extensa inclusão no núcleo de um astrócito. Fonte: Viral and prion diseases of the CNS, vet. uga.edu. Referência: Texto adaptado de: CUNHA G.R. et al. Detecção precoce e quantificação de vírus da cinomose por PCR quantitativa em tempo real (qPCR) em diferentes tecidos e fluidos de um cão. Clínica Veterinária, ano XVII, n.104, p.90-96, 2013. APPEL M.J.G. Cinomose in TILLEY L.P., SMITH JR. F.W.K. Consulta Veterinária em 5 minutos: espécies canina e felina, 3.ed. p.224-225, 2004. 8

[close]

p. 9

BIOLOGIA MOLECULAR ERLIQUIOSE CANINA E FELINA DIAGNÓSTICO POR PCR REAL TIME A Doença e sua Classificação A Erliquiose é uma patologia causada por rickettsias cujos vetores de transmissão da doença são carrapatos.  Sua distribuição é cosmopolita e acomete vários mamíferos, dentre eles cães, gatos e humanos (potencial zoonótico). A denominação “erliquiose” é uma descrição utilizada para caracterizar a infecção pelos parasitos intracelulares pertencentes à família Anaplasmataceae. A diferenciação entre as espécies foi baseada de acordo com a sequência genética dos agentes, de forma a se determinar o grau de parentesco entre as várias espécies do gênero. Didaticamente, as erliquioses recebem classificação de acordo com tipo celular atingido e espécie animal acometida:ErliquioseMonocítica Canina, causada pela Ehrlichia canis; ErliquioseGranulocítica Canina, causada por Ehrlichiaewingii e Anaplasmaphagocytophilum; ErliquioseTrombocítica Canina (atualmente Trombocitopenia Cíclica Canina), causada pelo Anaplasmaplatys; ErliquioseMonocítica Equina, causada pela Neorickettsiaristicii, Febre do Rio Potomac ou ErliquioseGranulocítica Equina, causada pelo Anaplasmaphagocytophilum; Erliquiose Bovina (Nopi), causada pelo Anaplasmabovis; Erliquiose ovina (atualmente, Anaplasmose Ovina), causada pelo Anaplasma ovis; ErliquioseGranulocítica Humana (atualmente, AnaplasmoseGranulocítica Humana), causada pelo Anaplasmaphagocytophilum; ErliquioseMonocítica Humana, causada pela Ehrlichiachaffeensis e pela Ehrlichia canis. Na Erliquiose Felina, os corpúsculos de inclusão e mórulas de Ehrlichia canis foram encontrados em células sanguíneas mononucleares e polimorfonucleares. Ehrlichia em célula monocítica. Fonte: mygermanshepherd.co.uk Transmissão e Diagnóstico Sua transmissão se faz pela inoculação de sangue proveniente de um animal infectado a outro sadio pelo intermédio de carrapatos, principalmente da espécie Rhipicephalussanguineus.A transmissão por outros vetores artrópodes ainda é discutida, porém a transmissão por meio de transfusão sanguínea pode existir, principalmente em animais com doença subclínica, sendo importante a triagem desses doadores, associada à tipagem sanguínea. O período de incubação varia de uma a três semanas com multiplicação em fígado, baço e linfonodos determinando assim a fase aguda da doença, onde a concentração de títulos de anticorpos classe IgM eleva-se no soro. Nessa fase os animais estão infectantes e além da detecção de IgM pode-se evidenciar o agente por meio de pesquisa parasitológica direta em esfregaço de sangue periférico (Pesquisa de Hematozoários, muito sujeita a falso negativo) ou mesmo pesquisa biomolecular por meio da técnica de PCR, sendo aconselhável a técnica quantitativa (PCR Real Time). Ocasionalmente a fase aguda não pode ser percebida, caracterizando uma infecção subclínica. Quando o sistema imune do indivíduo não está comprometido por outrasdoenças de base ou for eficiente, pode-se obter uma forma crônica sem sintomas, o que caracteriza animais portadores assintomáticos. Tais animais estão susceptíveis à “reagudização” e a evidenciarem o quadro sintomático. Na fase crônica da doença níveis de anticorpos classe IgG podem ser identificados pela técnica de Imunofluorescência Indireta (RIFI). Ensaios baseados em Imunocromatografia também devem ser utilizados na avaliação sorológica pareada com intuito de se avaliar títulos crescentes de IgG de modo a associar doença estabelecida em fase crônica, diferenciando assim de “cicatriz imunológica”, uma vez que títulos de IgG específicos contra Ehrlichia e Babesiapodem permanecer circulantes de 3 a 11 meses mesmo após tratamento 9

[close]

p. 10

BIOLOGIA MOLECULAR e cura clínica. Além disso, a reexposição (ambiente+vetor), mesmo após tratamento do indivíduo, favorece à nova infestação e provável reinfecção.Os sinais da doença podem ser inespecíficos e marcados por emagrecimento, caquexia, apatia, anorexia, febre intermitente, dores articulares, hiperestesia (felinos), sensibilidade à palpação e desidratação. Vasculite e conseqüentespetéquias podem ser achados comuns.Na avaliação hematológica completa e bioquímica sérica constituem-se achados importantes: trombocitopenia, hiperproteinemia marcada por hiperglobulinemia (principalmente frações alfa e gama evidenciadas na eletroforese), elevação de AST, ALT e Fosfatase Alcalina. Anemia e leucopenia também podem ocorrer dependendo da fase e intensidade da parasitemia. As células infectadas são transportadas pelo sangue para outros órgãos do corpo, especialmente pulmões, rins e meninges, e aderem-se ao endotélio vascular, induzindo vasculite e infecção tecidual subendotelial. O consumo, o seqüestro e a destruição das plaquetas parecem contribuir para a trombocitopenia durante a fase aguda. A contagem de leucócitos totais pode variar e a anemia, relacionada à supressão da produção de eritrócitos e a destruição acelerada dessas células, desenvolve-se progressivamente Figuras 1 e 2: Gato com carrapato. Fonte: oskarmaxim.blogspot durante a fase aguda. A trombocitopenia pode estar associada a um defeito adquirido da membrana plaquetária associado a elevações acentuadas em concentrações séricas de globulina (imunomediada). Ainda na fase crônica, a realização de um mielograma pode evidenciar hipoplasiamielóide, eritróide e megacariocítica associadas à hiperplasia linfoide e de plasmócitos, além da presença de mórulas. O material aspirado de medula óssea (mesmo com baixa carga parasitária e volume reduzido de amostra) pode ainda ser submetido à PCR Real Time, realizada pelo TECSA Laboratórios, em sistema fechado que minimiza contaminação e variável operacional humana, passando por 5 níveis de controle interno que garantem a realização de uma técnica com 99,99% de especificidade e sensibilidade superior a 95%. Além de utilizado no diagnóstico a metodologia que permite a quantificação, é uma ferramenta útil na avaliação do tratamento e prognóstico. É tecnologia de ponta associada a robustez e maior sensibilidade na execução de uma técnica com especificidade de 99,99%! Em pequenos animais a ocorrência de doenças imunossupressoras como Neoplasias, Leishmaniose, FIV e FeLV predispõe à instalação e desenvolvimento da doença em todas as espécies. Além das doenças de base supracitadas, vale ressaltar que a erliquiose pode ainda acometer o indivíduo em sinergismo como outras hemoparasitoses como Mycoplasmose,Babesiose,Anaplasmose, Tripanosomíase, Leishmaniose, Cytauxzoonose e Hepatozoonose, sendo importante considerá-las como possíveis diagnósticos associados ou mesmo diferenciais. Laboratorialmente provas sorológicas, pesquisa direta e testes biomoleculares estão disponíveis para complementar o diagnóstico e confirmar ou descartar outras doenças. Fontes: Texto adaptado de ALMOSNY, N. R P.; ALMEIDA, L. E.; MOREIRA, N. S. & MASSARD, C. L. Erliquiose clínica em gato (Feliscatus). Rev Bras. de Ciên. Vet. .5 (2) .8283, 1998. / ALMOSNY, N. R. P.; MASSARD, C. L. Erliquiose felina. Revista clínica Veterinária. 23. 30-32, 1990 / COUTO, C.G. Doenças Rickettsiais In: BIRCHARD, SHERDING, Manual Saunders: Clínica de pequenos animais. Ed. Roca: 139-42, 1998 / DAVOUST, B.; PARZY, D.; VIDOR, E.; HASSELOT, N.; MARTET, G. Ehrlichiosecanineexperimentale : étude clinique et terapeutique. Rev. Méd. Vét. 167: 33-40, 1991. / DAVOUST, B. – Canineehrlichiosis, Point Vét., 25 (151): 43-51, 1993. / ETTINGER, S. J. FELDMAN, E. C. Tratado de Medicina Interna Veterinária. 4 ed. São Paulo: Editora Manole. 1992. / GHORBEL, A.; CADORE, J.L.; CLERC, B.; BOUATTOUR, A.; VIDOR, E. SAYN, M.J. Efficiencyofoxytetracyclin in dogehrlichiosistreatment. Revue Med. Vet., 144 (2): 109-14, 1993. / GREGORY, C.; FORRESTER, S O. Ehrichia canis, E. equi, E. risticciinfections. In: GREENE, C.E. Infectiousdiseasesofthedogand cat. Philadelphia: W.B. Saunders: 404-14, 1990. / TAVARES, C.A.P. Erliquiose em pequenos animais: revisão de literatura. Nov.2012 10

[close]

p. 11

BIOLOGIA MOLECULAR COMPARAÇÃO DE PCR TEMPO REAL E PCR CONVENCIONAL PARA DETECÇÃO DE LEISHMANIA INFANTUM   Introdução diagnóstico por PCR convencional . A leishmaniose visceral canina Nos últimos anos, a técnica de reação (LVC) compreende um importante em cadeia da polimerase técnica (PCR problema de saúde pública, uma vez ) tem avançado significativamente no que é frequentemente fatal se não for sentido de expandir a sua utilização e tratada. Consequentemente, novos versatilidade, trabalhando agora com a métodos de diagnóstico que promovam quantificação do agente em tempo real a identificação precoce da doença são (qPCR). Dados da literatura mostram necessários. O diagnóstico da LVC pode que ambos os métodos apresentam ser realizado por exames parasitológicos características interessantes para o diretos que podem produzir resultados diagnóstico da leishmaniose visceral. falso-negativos, quer devido ao baixo Os benefícios de qPCR REAL TIME número de Leishmania spp.em amostras em relação ao PCR convencional clínicas (medula óssea e gânglios incluem velocidade, reprodutibilidade linfáticos), ou porque identificação e capacidade quantitativa. Em adição morfológica é complexa. Além disso, às vantagens operacionais, qPCR é tais métodos são invasivos. Técnicas mais sensível e reprodutível e pode sorológicas convencionais são passíveis substituir PCR convencional nas de reactividade cruzada com outras rotinas de diagnóstico. Além disso, a doenças parasitárias, especialmente utilização de uma técnica que possui grave quando se utiliza apenas um elevada sensibilidade de diagnóstico, e método sorológico isolado – por pode monitorizar a terapia e prevenção exemplo apenas ELISA . No entanto, de recaídas promove perspectivas mais métodos sorológicos são ainda a primeira amplas para o controle da doença. ferramenta diagnóstica a ser impregada nos levantamentos epidemiológicos ou Métodos de Amplificação do DNA em casos de animais saudáveis apenas para fins pré- vacinais. O diagnóstico PCR Convencional - cPCR precoce é importante para a prevenção Nas últimas duas décadas, a técnica de danos graves ou mesmo morte dos PCR convencional ( cPCR) foi animais doentes . Desde a produção do modificada para expandir seu uso e primeiro instrumento termociclador em versatilidade . A possibilidade de utilizar 1987, técnicas de biologia molecular têm na mesma reacção, um par de iniciadores prometido uma revolução na detecção com a amplificação simultânea de de agentes patogénicos em amostras múltiplas sequências de DNA alvo, é clínicas . Neste contexto, os métodos chamado multiplex-PCR. Assim, mais moleculares, essencialmente baseados do que uma sequência de DNA pode ser em PCR, tornaram-se ferramentas amplificado (multiplicada) pelo mesmo indispensáveis ​p​ara o diagnóstico de processo. Nested-PCR utiliza dois doenças infecciosas. Alta especificidade, pares de iniciadores para a amplificação a rápida identificação e quantificação de uma sequência de DNA interna do parasita, a possibilidade de no alvo seleccionado. O primeiro par aplicação direta em espécimes clínicos, é usado para uma reacção inicial, e os produzem resultados confiáveis​ produtos são então, submetido a uma em poucas horas e são inegáveis​​ segunda amplificação com um outro par vantagens de PCR Real Time (qPCR), de iniciadores. Esta técnica apresenta quando comparado aos métodos de maior sensibilidade e especificidade. No entanto, também revela um aumento do risco de contaminação do produto amplificado a partir da primeira reacção. Embora cnPCR e suas variações são sensíveis e altamente específicos, eles têm algumas limitações, incluindo a exigência de gel de agarose ou de poliacrilamida para electroforese, risco de contaminação, a falta de capacidade quantitativa, e a utilização de reagentes tais como brometo de etídio, que é prejudicial para o saúde do operador. O surgimento de uma nova tecnologia, qPCR ( PCR REAL TIME ), enfatizou essas limitações.   PCR em Tempo Real -qPCR PCR em tempo real foi desenvolvido em 1992, como um aperfeiçoamento da PCR original criada por Kary Mullis, e representa um avanço significativo na biotecnológica para o diagnóstico de doenças infecciosas e parasitárias . O sistema baseia-se na utilização de corantes fluorescentes ou sondas que permitem o controle do produto amplificado. Um corante é amplamente empregue e se liga não especificamente as cadeias duplas de DNA geradas durante a amplificação. Outra forma de gerar a fluorescência é a utilização de uma sonda especificamente dirigida para uma sequência de região interna que tem de ser amplificado, um exemplo desse sistema é a sonda TaqMan. Durante a amplificação o TaqMan é degradado e então ocorre a libertação da luz. A análise da emissão de luz é feita por um detector de sinal de luz que cria um gráfico com a absorção obtida após cada sonda de PCR, o sinal gerado reflecte a quantidade de produto formado . Os resultados qPCR são registrados através de sistemas interligados de computação gráfica gerados no termociclador. Basicamente, quatro tipos de análises são realizadas: curva de amplificação, 11

[close]

p. 12

BIOLOGIA MOLECULAR curva de dissociação, espectro e do componente . Os quatro parâmetros devem ser consideradas em conjunto. Padõres positivos e controles negativos devem ser incluídos em todas as reacções. A qPCR permite, basicamente, a realização de quatro tipos de testes: quantificação absoluta, quantificação relativa, análise de resolução de fusão elevado e discriminação alélica, que apresentam aplicações diferentes e variadas. Como uma ferramenta de diagnóstico, a quantificação absoluta pode ser usada para a detecção de infecção e quantificação do seu agente etiológico. O teste para a quantificação absoluta baseia-se na análise da curva padrão. Estas características de qPCR permitem a eliminação de uma fase (preparação de electroforese em gel) onde geralmente ocorrem as contaminações no método conveniconal de PCR . cPCR e qPCR para o diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina   Em 2002, um trabalho que avaliava dois métodos de cPCR encontraram uma sensibilidade de 100% para o sistema de RV1 / RV2 no sangue periférico de cães doentes . Os resultados animaram os pesquisadores a realizar um estudo sobre a capacidade de cPCR (RV1 / RV2) para detectar LVC em amostras diferentes (biópsias do fígado, baço e gânglios linfáticos) de cães . Os autores observaram que a maioria dos animais que foram positivos pela microscopia também foram positivos pela PCR. Tal descoberta pode, possivelmente, ser associado com o tipo da amostra em estudo ou com uma alta carga parasitária em animais com sintomas clássicos da doença. A sensibilidade relatada para o estudo realizado em 2002, também foi determinada por amostras de sangue de cães com sintomas múltiplos de LVC. Em um estudo mais atual,com o objetivo de avaliar cPCR na identificação do agente etiológico da LVC em cães, foram empregadas amostras de baço, fígado, rins e gânglios linfáticos de 25 animais sintomáticos (grupo caso) e 15 animais assintomáticos. Os cães eram de diferentes raças, sexos e idades, e foram de Teresina, Piauí, Brasil. Todos os animais do grupo caso e dois controles teste deram positivos em amostras de fígado , baço ou linfonodos por cPCR. A conclusão foi que , os resultados foram mais positivos por cPCR em cães soropositivos sintomáticos e cPCR é mais preciso do que a histopatologia convencional na detecção do parasita Leishmania . Este estudo e varios outros apos este , provam que o método de PCR convencional nao é adequado para o diagnóstico inicial em populações , ou seja animais assintomáticos especialmente . Os estudos mencionados mostraram ainda uma baixa reprodutibilidade de cPCR para o diagnóstico de LVC em amostras de sangue do cão. Outra possibilidade é que a eficiência da técnica está associada com a carga de parasitas, ou seja, os animais com uma elevada carga de parasita iriam apresentar resultados positivos usando a técnica cPCR. Segundo alguns autores, o uso de PCR em tempo real com iniciadores derivados do sistema de RV1 / RV2 no sangue e medula óssea revelou uma correlação adequada entre a carga parasitária e o estado clínico do paciente, que permitem concluir que a quantificação do parasita é necessária para uma leitura precisa dos resultados . Consequentemente, para verificar o andamento do PCR em tempo real para o diagnóstico de LVC, os pesquisadores compararam o sistema cPCR com qPCR na medula óssea de cães . Eles encontraram 54 e 84% de resultados positivos, respectivamente, para cPCR e qPCR (29).O que mostra claramente como o PCR por TEMPO REAL é superior em sensibilidade. As amostras que deram negativo para cPCR mostraram uma carga parasitária de menos de 30 parasitas / mL de medula óssea, ou seja , no PCR convencional o paciente com menos de 30 parasitas por mL dá resultado negativo, mas no PCR REAL TIME da positivo. Utilizando amostras de sangue periférico a partir de 15 cães que eram positivos para a leishmaniose visceral, a sensibilidade qPCR foi de 100%. O sistema desenvolvido por estes investigadores elucidou tambem que o uso de sangue como amostra para o diagnóstico em animais sintomáticos é o método menos invasivo e de alta sensibilidade. Considerações finais o qPCR já está disponível em vários laboratórios, especialmente no sector privado; no entanto, a interpretação de seus resultados requer novos níveis de conhecimento. Por isso, requer uma equipe treinada para garantir a precisão do método. Em adição às vantagens operacionais, qPCR é uma técnica sensível e reprodutível, que pode substituir cPCR nas rotinas de diagnóstico. O uso da técnica de alta sensibilidade que pode monitorar a terapia e pode prevenir recaídas promove perspectivas mais amplas para o controle da doença. Referencias Bibliográficas : Comparação de PCR em tempo real e de PCR convencional para a detecção de Leishmania (Leishmania) infantum infecção: uma minirevisão Paiva-Cavalcanti M (1), Regis-da-Silva CG (1), Gomes YM (1) (1) Departamento de Imunologia, Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Recife, Estado de Pernambuco, Brasil. 12

[close]

p. 13

BIOLOGIA MOLECULAR DIAGNÓSTICO DA LEPTOSPIROSE E TOXOPLASMOSE POR PCR – REAL TIME Leptorpirose De acordo com o Ministério da Saúde (2010) a Leptospirose é uma doença infecciosa febril de início abrupto. O agente etiológico é uma bactéria helicoidal (espiroqueta) aeróbica obrigatória do gênero Leptospira, do qual se conhecem atualmente 14 espécies patogênicas, sendo a mais estudada a L. interrogans. Dentre os fatores ligados ao agente etiológico que favorecem a persistência dos focos de leptospirose, deve-se ressaltar a capacidade de sobrevivência no meio ambiente (até 180 dias) e à ampla variedade de animais suscetíveis que podem hospedar o microrganismo. O principal reservatório são os roedores, entretanto outros importantes reservatórios são: caninos, suínos, bovinos, equinos, ovinos e caprinos. Na fase precoce, as leptospiras podem ser visualizadas no sangue, já na fase tardia podem ser encontradas na urina. A detecção pode ser por meio de exame direto, de cultura em meios apropriados, exames sorológicos e soroaglutinação. Entretanto, são notórias as falhas em decorrência da possibilidade de reações cruzadas com outros microorganismos. Sendo assim, para evitar “falsospositivos” seria necessário realizar exames de contraprova, como o exame parasitológico direto e a reação em cadeia pela polimerase (PCR, na sigla em inglês). Nesse caso, a mais eficiente metodologia é a PCR em tempo Real (qPCR). Diversos estudos já demonstraram que, devido à elevada sensibilidade do qPCR, é possível desmascarar “falsos-positivos”, como também a detecção de patógenos em animais que haviam apresentado resultados negativos à sorologia, elucidando, da mesma forma, os “falsosnegativos”. O PCR em tempo real é um exame imprescindível e muito sensível porque ele detecta especificamente a presença do DNA do parasita. Aspectos Clínicos Área Rural: dentre os animais de produção, explorados em ecossistemas rurais, as manifestações clínicas mais freqüentes atingem a esfera reprodutiva, incluindo o abortamento, usualmente no terço final da gestação, alta mortalidade neonatal e redução na produção de leite. Além disso, já foi demonstrado que a Leptospirose pode ser responsável por surtos de uveítes (inflamações oculares) em rebanhos eqüinos, caprinos e ovinos. Área Urbana: Dentre os animais de companhia mantidos em áreas urbanas, a leptospirose pode acometer o cão doméstico, provocando quadros febris com sinais variáveis de hemorragias, icterícia e uremia com alto grau de letalidade e óbito decorrente das insuficiências hepática e renal. Diagnóstico Laboratorial Através de exames complementares podem se chegar ao diagnóstico da doença. Com isso nós do TECSA Laboratórios com o objetivo de auxiliar o clínico em suas decisões disponibilizamos uma série de exames. EXAMES REALIZADOS PELO TECSA LABORATÓRIOS CÓD EXAME PRAZO/ DIAS MATERIAL 81 MÉTODO DE MICROAGLUTINAÇÃO 2 TUBO TAMPA VERMELHA 376 PESQUISA DE CAMPO ESCURO 2 URINA 785 PCR REAL TIME QUALITATIVO 7 SANGUE EM EDTA, URINA OU SORO 786 PCR REAL TIME QUANTITATIVO 7 SANGUE EM EDTA, URINA OU SORO 526 PERFIL DIAGNÓSTICO COMPLETO 2 TUBO TAMPA VERMELHA, ROXA E URINA 13

[close]

p. 14

BIOLOGIA MOLECULAR Toxoplasmose A Toxoplasmose é uma enfermidade causada por um protozoário chamado Toxoplasma gondii. É uma doença infecciosa e\ou congênita que acomete animais de produção (suínos, caprinos, bovinos, entre outros) e de estimação (principalmente gatos). Similarmente à Leptospirose é uma enfermidade que atinge a esfera reprodutiva, gerando abortos e nascimento de fetos mal formados, inclusive em seres humanos. Outra similaridade da Toxoplasmose com a Leptospirose é ser frequentemente causadora de surtos de uveítes em diversas espécies animais. Figura 1: As espiroquetas de Leptospira sp. aparecem como linhas escuras no interior de túbulos renais e\ou lúmen. Fonte: an Overview of Canine Leptospirosis, sweetshimas.com. Ocasionalmente, tais incidências podem gerar dúvidas e confusões durante o diagnóstico veterinário. Sendo assim, a qPCR, mais uma vez se destaca dentre tantas outras metodologias de diagnóstico, pois é a mais precisa na confirmação definitiva da presença do patógeno, seja ele bacteriano ou protozoário, como em casos de surtos de uveítes. Figura 2: Cisto tecidual contendo  bradizoítos. Fonte: Toxoplasma gondii, www.ufrgs.br. Existe uma elevada soroprevalência de T. gondii nos gatos, mas a doença clínica é rara, pois é um ciclo enteroepitelial e não costuma produzir sinais clínicos além de corrimento ocular e fezes pastosas a líquidas. O controle de tais enfermidades passa, necessariamente, pelo diagnóstico preciso. Em casos de animais domésticos a fim de evitar contaminações aos proprietários, e no caso de animais de produção, a partir do número de reativos em cada rebanho, avalia-se a conveniência de utilização de medidas sanitárias e de controle, tais como vacinação e tratamentos como antiparasitários, a fim de evitar maiores perdas econômicas para o criador. Diagnóstico Laboratorial O diagnóstico se baseia na associação da sintomatologia clínica com os testes realizados no TECSA laboratórios. Possuímos o maior menu de exames do Brasil, e os seguintes exames são oferecidos com os respectivos prazos de entrega: Aspectos Clínicos Casos benignos são descritos com quadros febris e discreto aumento ganglionar, até casos de grave comprometimento do sistema nervoso central, uveítes oculares, o aborto e mortalidade neonatal. A infecção é principalmente adquirida pela ingestão de cistos de T. gondii através de consumo de carne crua ou através de oocistos em alimentos contaminados por fezes de hospedeiros. Figura: Taquizoítos de Toxoplasma gondii (setas). Fonte: Toxoplasma gondii, www.ufrgs.br. 14

[close]

p. 15



[close]

Comments

no comments yet