Il Prometeo XII num.1

 

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DOTTORATO INTERNAZIONALE IN NEUROSCIENZE Anno XII Numero 1 Gennaio-Marzo 2017 Rivista trimestrale on-line IL PROMETEO Bollettino di Dottorato ANNO XII Direttore: Prof. Filippo Drago registrazione presso il Tribunale di Catania n. 006 del 1 febbraio 2016 Direttore: Prof. Filippo Drago Microvescicole microgliali e la comunicazione glia-neuroni nella neuroinfiammazione Università degli Studi di Catania Via Santa Sofia n. 97 Tel.: +39 095 4781191 Tel.: +39 095 4871351 il_prometeo@email.it http://www.unict.it/dfsc Le cellule microgliali, rappresentano le cellule immuni del sistema nervoso centrale (SNC) e sono la prima linea di difesa durante un’infezione o una lesione cerebrale e, in risposta a molteplici segnali d’allarme, possono andare incontro ad un processo di attivazione assumendo le caratteristiche di cellule effettrici pro-infiammatorie. Tuttavia, è ben noto che la microglia contribuisce anche al mantenimento della plasticità neuronale con un’azione di tipo protettivo verosimilmente mediata dal rilascio di fattori di crescita. La microglia, sotto opportuna stimolazione, è inoltre in grado di produrre microvescicole (MVs) le quali a loro volta rappresentano un innovativo ed importante meccanismo di comunicazione cellulare. Le MVs appartengono alla famiglia delle vescicole extracellulari comprendente anche gli esosomi. Questi ultimi hanno una particolare morfologia e composizione biochimica che riflette la loro origine endosomiale. Il meccanismo di rilascio degli esosomi dalle cellule comporta la fusione di endosomi multivescicolari, con un processo analogo alla secrezione dei granuli secretori. Gli esosomi possono assumere un ruolo significativo sia in condizioni fisiologiche che patologiche essendo al loro interno ricchi di diversi componenti rilevanti quali molecole MHC di classe I e II, proteine G trimeriche, proteine citoscheletriche, annessina, in- 1

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tegrine, proteinchinasi della famiglia Src (Lyn) e tipici marcatori di microdomini, come CD55, CD58, CD5. Gli esosomi si distinguono dalle MVs anche per le loro piccole dimensioni ( diametro compreso tra 50 e 80 nm) tanto che la loro visualizzazione è possibile unicamente mediante immunoelettromicroscopia. Le MVs sono strutture membranose differenti per struttura e dimensione dagli esosomi. Esse vengono rilasciate sia in vivo, nel plasma e nei vari fluidi corporei, sia in vitro, dalle colture cellulari. Hanno una dimensione compresa tra i 100 ed i 1000 nm ed originano direttamente dai raft lipidici della membrana plasmatica attraverso un processo di blebbing. Le MVs, la cui composizione dipende dal tipo cellulare da cui derivano, possono intervenire nella comunicazione intercellulare essendo ricche di molecole bioattive quali RNA, microRNA e proteine trasferibili a cellule bersaglio. Attraverso il trasferimento di molecole bioattive, le MVs svolgono un rilevante ruolo sia in contesti fisiologici che in condizioni patologiche e potrebbero costituire biomarcatori per la diagnosi e la sorveglianza di determinate condizioni di salute e avere applicazioni terapeutiche. Numerosi dati presenti in letteratura suggeriscono che le MVs esercitino un importante ruolo nella neuroinfiammazione. I recettori metabotropici del glutammato (mGlu) appartengono alla classe dei recettori associati a proteine G e vengono attivati dall’amminoacido eccitatorio per eccellenza, il glutammato. Tali recettori formano una famiglia che comprende 8 sottotipi recettoriali a loro volta suddivisi in tre principali gruppi, in base alla sequenza amminoacidica, al profilo farmacologico e alle vie di trasduzione del segnale. Del primo gruppo fanno parte mGlu1 e mGlu5, i quali sono recettori associati a proteine Gq/G11. La loro attivazione stimola l’idrolisi dei polifosfoinositidi con conseguente produzione di inositolo-1,4,5-trifosfato e diacilglicerolo. Al secondo gruppo appartengono mGlu2 e mGlu3, associati a proteine G0/Gi. Quando attivati, questi recettori determinano la riduzione della formazione di AMP ciclico a livello intracellulare e l’inibizione dei canali del calcio voltaggio-dipendenti. Il terzo gruppo comprende invece mGlu4, mGlu6, mGlu7 e mGlu8, anch’essi associati a proteine G0/Gi. Come riportato in letteratura, il recettore mGlu5, è coinvolto nella regolazione della trasmissione sinaptica ed è fortemente implicato in meccanismi di neuroprotezione e neurodegenerazione. Tale recettore è stato più recentemente associato a processi di neuroinfiammazione nel corso dei quali può esercitare un’azione anti-infiammatoria o pro-infiammatoria. La dualità del recettore mGlu5 in un contesto neuroinfiammatorio ha rappresentato quindi il punto di partenza della nostra ricerca. Il mio progetto di ricerca durante i miei anni di Dottorato in Neuroscienze, ha dunque lo scopo di definire il ruolo del recettore mGlu5 a livello microgliale, se MVs di origine microgliale possano modificare la vitalità neuronale e in che modo l’attivazione del recettore mGlu5 nelle cellule microgliali possa modificare tale risposta. Sulla base di queste premesse e di questi obiettivi, abbiamo innanzitutto puntato l’attenzione su citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale (TNF) α, espresse in cellule microgliali mediante analisi di western blot e citofluorimetria. I dati ottenuti dimostrano che la stimolazione del recettore mGlu5 contrasta l’incremento della citochina pro-infiammatoria indotto dall’esposizione a LPS suggerendo che il recettore mGlu5 svolga un ruolo anti-infiammatorio. Il ruolo delle MVs è stato valutato inducendo la formazione di MV in colture microgliali primarie di ratto o in cellule BV2, una linea cellulare microgliale murina usata come modello di microglia primaria. La formazione di MVs è stata indotta mediante la stimolazione in vitro del recettore purinergico P2X7 con ATP o un analogo più potente e stabile il Benzoyl-ATP. Con esperimenti di in time lapse, al microscopio,abbiamo potuto osservare che l’attivazione del recettore P2X7 causa una progressiva produzione di MV dalla superficie cellulare, accompagnata da rilevanti cambiamenti morfologici a livello della membrana plasmatica. Le MVs isolate tramite centrifugazioni in serie, sono state raccolte ed utilizzate per la loro quantificazione e valutazione del contenuto o trasferite su colture neuronali in modo da esaminare la loro capacità di mediare interazioni tra diversi tipi cellulari. Allo scopo di indagare se l’attivazione del recettore mGlu5 microgliale possa modificare la comunicazione microglia-neuroni tramite MVs sono stati utilizzati modelli di tossicità neuronale. Test di vitalità cellulare hanno dimostrato che in risposta ad uno stimolo tossico, si verifica una riduzione della vitalità cellulare in colture neuronali in cui sono state aggiunte MVs derivanti da cellule microgliali resting esposte ad un agonista del recettore mGlu5. In contrasto, la stimolazione del recettore mGlu5 nella microglia attivata provoca una riduzione della morte neuronale. Anche nel nostro modello si conferma quindi che il recettore mGlu5 è in grado di mediare un’attività anti-infiammatoria in cellule attivate da uno stimolo pro-infiammatorio. Allo stesso tempo, le MVs possono rappresentare una via alternativa sfruttata dalla microglia per influire sulla vitalità neuronale. In questo caso si ritiene però che la stimolazione del recettore mGlu5 causi un incremento della tossicità a livello dei neuroni sebbene in presenza di uno stimolo pro-infiammatorio, tale recettore possa ancora esercitare un’azione protettiva. Il lavoro di ricerca effettuato finora apre le porte a ulteriori studi volti a comprendere in che modo il recettore mGlu5 agisca a livello neuroinfiammatorio, e quale possa essere il peso relativo delle MVs le quali rappresentano veicoli di varie sostanze tra cui citochine pro-infiammatorie e microRNA, a loro volta capaci di influenzare la vitalità delle cellule target. Tutte le ricerche riguardanti lo studio del recettore mGlu5 nella nuroinfiammazione ed il suo coinvolgimento sull’azione delle MVs a livello neuronale, sono state condotte presso la sezione di Farmacologia del Dipartimento di Scienze Biomediche e Biotecnologiche dell’Università degli studi di Catania. Desidero ringraziare la Prof.ssa Maria Angela Sortino che con costanza e dedizione mi ha dato la possibilità di intraprendere questo percorso scientifico arricchendo il mio bagaglio formativo e professionale. Desidero inoltre rivolgere il mio ringraziamento alla Dott.ssa Sara Merlo e alla Dott. ssa Simona Spampinato che mi guidano con passione in questo progetto e mi danno un costante sostegno a livello professionale ma anche umano. Colgo l’occasione per ringraziare il Prof. Filippo Drago ed il Prof. Salvatore Salomone per avermi dato l’opportunità di iniziare un interessante e affascinante lavoro di ricerca all’interno del Dottorato in Neuroscienze. Martina Beneventano 2

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ABSTRACT Neurol Sci. 2017 Jan 11. doi: 10.1007/s10072-016-2797-1. [Epub ahead of print] Rediagnosing one of Smith’s patients (John McCann) with “neuromas tumours” (1849). Ruggieri M, Praticò AD, Caltabiano R, Polizzi A In 1849, the Irish Professor of Surgery, Sir Robert William Smith, by publishing his “Treatise on the Pathology, Diagnosis and Treatment of Neuroma”, collected six previous examples of “general development of neuromatous tumours” and reported three further cases (two personal and one referred) of what is nowadays known as neurofibromatosis. Among these latter cases, there was a 35-year-old cattle-driver, John McCann, who was first admitted at hospital in 1840 because of a large tumour on the right side of his neck thought to be malignant (and a second tumour sublingually) but not operated. McCann was readmitted in 1843 (“in an emaciated state”), because of an immense tumour in his thigh dying few months later “with hepatic symptoms”. Smith’s post-mortem examination revealed dozens of smaller additional tumours. Based on application of modern diagnostic criteria (to McCann’s portrait at second referral) and on pathological grounds (reconsideration of the histopathological report of McCann’s neuroma of the thigh), we tentatively hypothesise that this patient could be the earliest (illustrated) example of either: (1) a malignant peripheral nerve sheath tumour (MPNST); (2) neurofibromatosis type 2 (NF2); or (3) schwannomatosis (SWNTS). The progressively enlarging masses, the emaciated state and the later death are in favour of a MPNST (against is the lack of malignant appearance at histopathology); the clinical (and gross pathological) appearance of the tumours as large, rounded, encapsulated, eccentric lesions deflecting the parent nerve over the surface of the tumour is typical of schwannomas (thus, in favour of NF2 or SWTNS). Whatever diagnosis we could consider these tumours could be secondary to a (local) mosaic loss of heterozygosity and ultimately represent type 2 segmental manifestations superimposed on an ordinary autosomal dominant trait (i.e., NF1, NF2 or SWTNS). Cell Biochem. 2017 Jan 20. doi: 10.1002/jcb.25899. [Epub ahead of print] Caffeine Prevents Blood Retinal Barrier Damage in a Model, In Vitro, of Diabetic Macular Edema. Maugeri G, D’Amico AG Rasà DM, La Cognata V, Saccone S, Federico R, Cavallaro S, D’Agata V. Diabetic macular edema (DME) is the major cause of vision loss in patients affected by diabetic retinopathy. Hyperglycemia and hypoxia, represent the key elements in the progression of this pathologies, leading to breakdown of the blood-retinal barrier (BRB). Caffeine, a psychoactive substance largely consumed in the world, is a nonselective antagonist of adenosine receptors (AR) and it possesses a protective effect in various diseases, including eye patho- 3 logies. Here, we have investigated the effect of this substance on BRB integrity following exposure to hyperglycemic/hypoxic insult. Retinal pigmented epithelial cells, ARPE-19, have been grown on semi-permeable supports mimicking, an experimental model, in vitro, of outer BRB. Caffeine treatment has reduced cell monolayer permeability after exposure to high glucose and desferoxamine as shown by TEER and FITC-dextran permeability assays. This effect is also mediated through the restoration of membrane’s tight junction expression, ZO-1. Moreover, we have demonstrated that caffeine is able to prevent outer BRB damage by inhibiting apoptotic cell death induced by hyperglycemic/hypoxic insult since it down-regulates the pro-apoptotic Bax and up-regulates the anti-apoptotic Bcl-2 genes. Although further studies are needed to better comprise the beneficial effect of caffeine, we can speculate that it might be use as an innovative drug for DME treatment. This article is protected by copyright. All rights reserved. Mol Cell Neurosci. 2016 Dec 28. pii: S1044-7431(16)30276-7. doi: 10.1016/j.mcn.2016.12.003. [Epub ahead of print] Role of the adhesion molecule F3/Contactin in synaptic plasticity and memory. Gulisano W, Bizzoca A, Gennarini G, Palmeri A, Puzzo D. Cell adhesion molecules (CAMs) have a pivotal role in building and maintaining synaptic structures during brain development participating in axonal elongation and pathfinding, glial guidance of neuronal migration, as well as myelination. CAMs expression persists in the adult brain particularly in structures undergoing postnatal neurogenesis and involved in synaptic plasticity and memory as the hippocampus. Among the neural CAMs, we have recently focused on F3/Contactin, a glycosylphosphatidyl inositol-anchored glycoprotein belonging to the immunoglobulin superfamily, involved in neuronal development, synaptic maintenance and organization of neuronal networks. Here, we discuss our recent data suggesting that F3/Contactin exerts a role in hippocampal synaptic plasticity and memory in adult and aged mice. In particular, we have studied long-term potentiation (LTP), spatial and object recognition memory, and phosphorylation of the transcription factor cAMP-Responsive-Element Binding protein (CREB) in a transgenic mouse model of F3/ Contactin overexpression. We also investigated whether F3/Contactin might influence neuronal apoptosis and the production of amyloid-beta peptide (Aβ), known to be one of the main pathogenetic hallmarks of Alzheimer’s disease (AD). In conclusion, a further understanding of F3/Contactin role in synaptic plasticity and memory might have interesting clinical outcomes in cognitive disorders, such as aging and AD, offering innovative therapeutic opportunities.

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Oncotarget. 2017 Jan 18. doi: 10.18632/oncotarget.14715. [Epub ahead of print] Wilms’ tumor gene 1 silencing inhibits proliferation of human osteosarcoma MG-63 cell line by cell cycle arrest and apoptosis activation. Graziano AC, Cardile V, Avola R, Vicario N, Parenti C, Salvatorelli L, Magro G, Parenti R. Wilms’ tumor gene 1 (WT1) plays complex roles in tumorigenesis, acting as tumor suppressor gene or an oncogene depending on the cellular context. A high WT1 expression level was described in various types of human bone and soft-tissue sarcomas, including osteosarcoma (OS), but its function in carcinogenesis is not yet well understood. This study investigated WT1 both in human OS tissues and in human OS MG-63 cell line in which WT1 gene is up-regulated. The results demonstrated that WT1 is expressed in 50% of human OS cases. WT1-silenced MG-63 cells showed deregulation of proteins of cell cycle and down-regulation of PI3K/AKT pathway. Induction of apoptotic programme was also established by activation of caspase-3 and increase of Bax/Bcl2 ratio and p53 protein. This study provided new findings on role of WT1 and indicated an association between WT1 expression, cell cycle and apoptotic machinery. In conclusion, WT1 acts as a tumour promoter in osteosarcoma and it could be a potential therapeutic target. children. We also report on the main disorders that cause ataxia in children. RESULTS: The causal events are distinguished and reported according to the course of the disorder: acute, intermittent, chronic-non-progressive and chronicprogressive. CONCLUSIONS: Molecular research in the field of ataxia in children is rapidly expanding; on the contrary no similar results have been attained in the field of the treatment since most of the congenital forms remain fully untreatable. Rapid recognition and clinical evaluation of ataxia in children remains of great relevance for therapeutic results and prognostic counseling. KEYWORDS: Acute cerebellitis; Ataxia; Cerebellar malformations; Cerebellar syndrome; Diagnostic maneuvers CISSN ANIMAL MODELS OF HUMAN BRAIN DISEASES Ital J Pediatr. 2017 Jan 13;43(1):6. doi: 10.1186/s13052-016-0325-9. Ataxia in children: early recognition and clinical evaluation. Pavone P, Praticò AD, Pavone V, Lubrano R, Falsaperla R, Rizzo R, Ruggieri M. BACKGROUND: Ataxia is a sign of different disorders involving any level of the nervous system and consisting of impaired coordination of movement and balance. It is mainly caused by dysfunction of the complex circuitry connecting the basal ganglia, cerebellum and cerebral cortex. A careful history, physical examination and some characteristic maneuvers are useful for the diagnosis of ataxia. Some of the causes of ataxia point toward a benign course, but some cases of ataxia can be severe and particularly frightening. METHODS: Here, we describe the primary clinical ways of detecting ataxia, a sign not easily recognizable in 4

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